十大技術之一（一）西瓜資源與品種核酸指紋鑒定關鍵技術

張海英 許勇

當前西瓜生產中種子質量問題比較突出和普遍，種子純度不夠和假種子坑農事件常有發生，常規的品種審定/鑒定主要以形態學特征為依據，鑒定周期較長，長達3—4個月，因此，急需建立早期、快速、準確的西瓜種子純度和品種真實性檢測技術。

1 技術概述

在西瓜全基因組測序與重測序的研究基礎上，研發了一套最大限度準確反映西瓜品種資源多樣性與遺傳親緣關系23對SSR核心引物序列，并利用核心引物建立1 300多個西瓜種質資源的核酸指紋庫（圖1、表1）。圖1、表1顯示分析結果基本一致。

2 技術要點

1）DNA提取：取植株下胚軸或幼葉30～40 mg，CTAB法或堿法快速提取DNA。

2）PCR擴增體系：每種dNTP 0.25 mmol·L-1， 正向引物0.2 μmol·L-1，反向引物0.2 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，10×PCR緩沖液（含Mg2+），樣品DNA 60 ng，其余以超純水補足。推薦使用15或20 μL反應體積。

3）PCR擴增程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，循環34次；最后72 ℃ 延伸4 min。10 ℃ 保溫待用。

4）PCR產物檢測：8% 聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分離，采用快速銀染法顯色。

3 技術實施效果

3.1 西瓜品種純度和真實性分析

利用SSR核心引物組合，可有效區分95%以上的供試育種材料，特別是對于來源于共同祖先的親緣關系極近的材料，其外觀表型性狀極其相近，采用常規田間種植觀察較難準確區分，如京欣類型材料97103和98R，二者果實外觀、植株形態等極似，但引物BVWS00106可以有效區分二者（圖2）。目前，采用SSR核心引物組合，已對本中心育成的京欣2號、京闌、京玲、華欣等西瓜新品種進行了純度鑒定，分子鑒定和田間鑒定吻合率達95%以上（圖3）。

3.2 西瓜育種材料遺傳背景分析

利用篩選得到的SSR核心引物組合對 17份重測序材料和100份西瓜育種材料進行聚類分析，聚類結果與供試材料系譜相對照，基本反映出了供試材料種質資源親緣關系的遠近。該分類結果從DNA水平上體現了這些種質資源的親緣關系，可以為西瓜育種親本選擇提供理論依據（圖4）。