乙酰丁香酮及共培養pH對黃瓜遺傳轉化效率的影響

寧宇　李蕾　苗永美　李季　陳勁楓

摘 要： 以黃瓜品種長春密刺子葉節為外植體，研究了乙酰丁香酮（AS）的添加方式、濃度及共培養pH對黃瓜遺傳轉化的影響。結果表明：在侵染菌液和共培養基中加入AS均可顯著提高黃瓜抗性芽誘導率，濃度以100 μmol·L-1為最佳。共培養基的pH 對黃瓜抗性芽誘導率也有影響，其中在pH 5.2的共培養基上黃瓜轉化率最高。研究結果優化了黃瓜遺傳轉化體系，提高了黃瓜轉化效率，為推動黃瓜轉基因工作奠定了堅實的基礎。

關鍵詞： 黃瓜； 遺傳轉化； 乙酰丁香酮； pH

黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種重要的經濟作物，在全世界范圍內有較大的種植面積。黃瓜遺傳基礎狹窄，種質資源較少，很多重要的遺傳性狀無法通過有性雜交的手段來改良。因此，基因工程技術就成為對常規育種的有效補充手段。農桿菌介導的子葉節法是黃瓜轉基因中最為常用的方法[1]，目前已通過這種方法將iaaM[2]、BnCS[3]及opd[4]等基因轉入到黃瓜當中。但目前這種方法應用的最大瓶頸是黃瓜的再生困難、轉化效率低，因此如何提高黃瓜的轉化率，建立穩定、高效的轉化體系是黃瓜遺傳轉化過程中急需解決的問題。

乙酰丁香酮（AS）是宿主細胞分泌出的一種酚類化合物，它可以通過增強農桿菌的侵染效果來提高基因的轉化效率。目前在水稻[5]、辣椒[6]及楊樹[7]等多種作物的基因轉化過程中都會添加一定濃度的AS來提高轉化效率。AS的作用效果受多種因素的影響，如植物種類、AS的添加方式和濃度、菌株和載體類型、共培養pH及對AS產生協同作用的物質等[8]。其中AS的添加方式和濃度及共培養pH是較為重要的3個因素，探討這三者對黃瓜轉化率的影響對于優化黃瓜遺傳轉化體系具有十分重要的意義，而目前這方面的研究還未見報道。

本文以黃瓜品種長春密刺為試材，就AS的添加方式、濃度及共培養pH對黃瓜遺傳轉化效率的影響進行了探討，以明確AS在黃瓜遺傳轉化過程中的使用條件和方法及最佳共培養pH，建立穩定、高效的黃瓜遺傳轉化體系，為提高黃瓜轉化效率、推動黃瓜轉基因工作的前進奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室保存的華北型黃瓜長春密刺的高代自交系。

1.1.2 菌株和質粒 所用農桿菌菌株為EHA105（Rif R，Kan R），由本實驗室保存和提供。植物表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3由本實驗室構建，載體上攜帶標記基因HYG（潮霉素）、目的基因CsCBF3[9]、GUS基因、GFP基因，CaMV35S啟動子及NOS終止子，圖譜如圖1所示。

圖1 植物表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3的

T-DNA區圖譜

1.2 方法

1.2.1 農桿菌-子葉節法轉化黃瓜 試驗于2012年3月在南京農業大學進行。選取飽滿的長春密刺種子，在0.1% 的升汞溶液中消毒滅菌8 min，無菌水沖洗4～6次后用濾紙吸干表面水分，然后接種在MS培養基上。（25±2）℃ 條件下暗培養2 d后轉至光下繼續培養，4～5 d后切取子葉節，接種在預培養基上黑暗中預培養2 d。

挑取攜帶表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3的農桿菌EHA105單菌落，接種于YEB+50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif液體培養基中，28 ℃條件下震蕩培養16 h。離心后棄去上清液，加入MS0液體培養基重懸至OD600為0.6作為侵染液。將經過預培養的黃瓜子葉節置于MS0農桿菌菌液中侵染10 min，吸干菌液后接種在共培養基上，暗培養3 d后轉接至選擇培養基上，每2周繼代培養1次。

1.2.2 乙酰丁香酮處理 1）侵染菌液中加入乙酰丁香酮：在MS0農桿菌菌液中加入乙酰丁香酮，使終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1，低速震蕩培養1 h以活化農桿菌，然后將其作為侵染菌液用于侵染，每處理3次重復。2）共培養基中加入乙酰丁香酮：試驗采取兩因素正交設計，將共培養基pH分別設為4.9、5.2、5.5、5.8，在每個pH水平上分別添加乙酰丁香酮至終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1，以未添加AS的MS0農桿菌菌液為侵染液，每處理3次重復。

1.2.3 數據統計及分析 抗性芽在選擇培養基上進行繼代培養，繼代2～3次（選擇培養30 d）后統計長芽外植體數與總外植體數。將抗性芽誘導率（用產生抗性芽的外植體數與總外植體數的比值的百分率表示）作為評價黃瓜轉化率的指標。利用SPSS 20.0軟件對數據進行均值、標準差計算及顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 侵染菌液中添加AS對黃瓜轉化效率的影響

將預培養2 d的黃瓜子葉節浸至于添加了不同濃度乙酰丁香酮的菌液當中侵染，侵染后先在共培養基上暗培養3 d，然后接種在選擇培養基上篩選，30 d后統計抗性芽誘導率。結果表明（表1），與對照相比，侵染菌液中添加AS可顯著的提高黃瓜抗性芽誘導率。隨著其濃度的增加，抗性芽誘導率也隨之升高，濃度為100 μmol·L-1時達到最高。若AS濃度繼續增加，誘導率反而下降。說明在侵染菌液中加入AS可有效提高黃瓜的轉化率，但濃度不宜過高，以100 μmol·L-1為最佳。

表1 菌液中添加乙酰丁香酮對

抗性芽誘導率的影響

[注] 大寫字母表示差異極顯著（P<0.01），小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同。

2.2 共培養基中不同AS濃度與pH組合對黃瓜轉化效率的影響

將預培養2 d的黃瓜子葉節浸至于未添加乙酰丁香酮的菌液中侵染，侵染后接種在不同濃度AS和pH組合的培養基上共培養3 d，然后轉至選擇培養基上進行篩選培養，30 d后統計總外植體數和長芽外植體數，計算抗性芽誘導率（表2）。結果表明，不同濃度的AS和不同共培養基pH的配合使用對黃瓜抗性芽誘導率有顯著影響。在不同的組合當中，在不添加AS的pH為4.9或5.8的共培養基上獲得的抗性芽誘導率最低，均為13.33%。而在pH為5.2的共培養基上添加100 μmol·L-1的AS時獲得的黃瓜抗性芽誘導率最高，達到44%，因此，該組合可作為黃瓜轉化過程中最適的共培養條件。

2.3 共培養基中AS濃度對黃瓜轉化效率的影響

從表3可以看出，乙酰丁香酮濃度單因素的F值達到了極顯著的水平，說明共培養階段AS濃度對黃瓜抗性芽誘導率有極大的影響，因此本研究將其作為主效應因子就其對黃瓜轉化率的影響規律進行了分析。結果表明（表4），與不添加AS的對照相比，共培養基中添加AS可顯著提高黃瓜抗性芽誘導率。在本研究所設的AS濃度范圍內，隨著濃度的增加，黃瓜抗性芽誘導率也不斷升高，并且在濃度為100 μmol·L-1時達到最大，為38.05%。但隨著AS濃度繼續升高，誘導率反而降低，原因可能是AS配制時一般使用二甲基亞砜（DMSO）溶解，而二甲基亞砜有劇毒，濃度過高抑制了農桿菌的生長。

表4 共培養基中乙酰丁香酮濃度對

抗性芽誘導的影響

2.4 共培養pH對黃瓜轉化效率的影響

共培養 pH 的高低也會影響農桿菌的侵染效果，為探索黃瓜轉化過程中最適的共培養pH，將其作為主效應因子對其進行分析。統計結果顯示（表5），不同共培養pH條件得到的黃瓜抗性芽誘導率不同。當pH為5.8時，黃瓜抗性芽誘導率最低，僅為22.59%。而pH為5.2時黃瓜抗性芽誘導率最高，為31.65%，但與共培養pH為5.5時的誘導率差異并不顯著。因此可得出結論，pH為5.2～5.5的共培養基較適宜黃瓜轉化。

3 討 論

乙酰丁香酮是一種酚類化合物，其主要作用機理是通過誘導農桿菌Vir區基因的活化和表達，將T-DNA區從T兩側25 bp邊緣序列中切割下來，促進了DNA的轉移，使農桿菌T-DNA更易進入植物基因組并與其整合[10]。根據乙酰丁香酮的作用機理在使用過程中一般分為菌液中添加、共培養基中添加以及在菌液和共培養基中共同添加3種方法，如在藍豬耳遺傳轉化時在根癌農桿菌菌液中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮，可使轉化芽誘導率從5.76%提高到12.1%[11]；在研究杉木轉基因時，在共培養基中加入80 μmol·L-1乙酰丁香酮，Kan抗性芽的產生頻率比對照有了明顯提高[12]。當然，還有一些其他有效利用乙酰丁香酮的方法，如在甘薯外植體傷口處滴加乙酰丁香酮也可顯著提高抗性芽獲得率[13]。本研究分別在侵染菌液和共培養基中添加了一定濃度的乙酰丁香酮，結果表明，與對照相比，這2種方法均可顯著提高黃瓜抗性芽的誘導率。

在遺傳轉化過程中，不同物種的最適乙酰丁香酮濃度也不盡相同。在黃柏遺傳轉化時加入60 μmol·L-1乙酰丁香酮轉化率最高[14]，向日葵遺傳轉化共培養基中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮最有利于提高轉化率[15]，而丹參遺傳轉化共培養基中乙酰丁香酮的最適濃度為400 μmol·L-1[16]。本文對黃瓜最適的乙酰丁香酮濃度進行了探索，發現加入100 μmol·L-1的乙酰丁香酮可大幅提高黃瓜抗性芽的誘導率。

pH值的高低對乙酰丁香酮的誘導效果也有著明顯的影響，從理論上講，含乙酰丁香酮的培養基pH為5.0～5.5時，乙酰丁香酮的誘導效果較好。前人研究表明[17]，乙酰丁香酮在pH值5.2的條件下轉化效果最好。本文研究了pH值對黃瓜遺傳轉化的影響，試驗結果表明共培養pH 5.2時黃瓜的抗性芽誘導率最高，但其對于黃瓜抗性芽誘導率影響并不顯著。

本文對黃瓜遺傳轉化過程中乙酰丁香酮的使用進行了較為系統的研究，進一步優化了黃瓜的遺傳轉化體系，為推動黃瓜轉基因工作的前進奠定了堅實的基礎。

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