RNAscope原位雜交技術(shù)在肺結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用價值

毛 昕,李紅娜,吳晨陽,羅 丹,宋旭東

結(jié)核病是嚴(yán)重危害公眾健康的慢性傳染病,中國的發(fā)病率較高[1]。肺結(jié)核常用的診斷方法是病理檢查,典型的組織學(xué)改變?yōu)閴乃佬匀庋磕[性炎,但壞死性肉芽腫病變并非結(jié)核病的特有表現(xiàn)。qRT-PCR法具有較高的敏感度和特異度,但對標(biāo)本、實驗室環(huán)境要求苛刻,且易破壞組織的完整性。RNAscope原位雜交技術(shù)(簡稱RNAscope技術(shù))具有較高的敏感性和特異性,可在保留組織形態(tài)的基礎(chǔ)上原位觀察RNA的表達[2]。本文探討RNAscope技術(shù)在肺結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用價值,為結(jié)核病的診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1月～2022年6月我院病理科肺結(jié)核的石蠟包埋標(biāo)本72例為確診組,另選取34例非結(jié)核性肉芽腫(肺結(jié)節(jié)病10例、慢性非壞死性肉芽腫性炎24例)為對照組。臨床資料顯示,患者均無惡性腫瘤、慢性基礎(chǔ)性疾病、免疫抑制劑和抗結(jié)核治療等病史。

1.2 qRT-PCR法石蠟包埋組織DNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒(靶基因為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共同插入序列IS6110),均購自北京鑫諾美迪公司,應(yīng)用ABI 7500 qRT-PCR儀進行核酸擴增。石蠟標(biāo)本5 μm厚連續(xù)切片8張,置于1.5 mL離心管中,操作步驟按試劑盒說明書進行。擴增結(jié)果呈S形擴增曲線且Ct值≤40為陽性,Ct值>40或無Ct值為陰性。

1.3 RNAscope技術(shù)結(jié)核分枝桿菌23S rRNA探針、RNAscope 2.5 HD試劑盒,均購自美國ACD公司。石蠟標(biāo)本5 μm厚連續(xù)切片、烤片,實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。陽性呈棕色細桿狀或顆粒狀物,易出現(xiàn)在壞死區(qū)和壞死周圍類上皮細胞中。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。一致性分析采用Kappa值,Kappa值≤0.4兩者一致性差,0.40.8一致性很好[3]。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點確診組中男、女性各36例,中位年齡49歲,其中活檢標(biāo)本42例,手術(shù)切除標(biāo)本30例,均可見壞死性肉芽腫改變(圖1)。對照組中男性16例,女性18例,中位年齡50歲,其中活檢標(biāo)本17例,手術(shù)切除標(biāo)本17例。兩組標(biāo)本來源均為肺組織,活檢標(biāo)本與手術(shù)標(biāo)本均無重復(fù)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,兩組患者性別、年齡、標(biāo)本類型,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05,表1)。

表1 肺結(jié)核與非結(jié)核性肉芽腫臨床特點

圖1 結(jié)核性肉芽腫,中心為干酪樣壞死,周圍見類上皮細胞和多核巨細胞

2.2 RNAscope技術(shù)與qRT-PCR法檢測效能分析采用qRT-PCR法檢測確診組中結(jié)核分枝桿菌DNA插入序列IS6110陽性58例(圖2),對照組中陽性2例,其診斷敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度分別為80.56%(58/72)、94.12%(32/34)、96.67%(58/60)、69.57%(32/46)和84.91%(90/106)。對照組中有2例陽性為結(jié)節(jié)病患者,檢測的Ct值分別為39.09、39.54,再次檢測Ct值分別為38.97、39.05。RNAscope技術(shù)檢測確診組中結(jié)核分枝桿菌23S rRNA陽性51例(圖3、4),對照組中無陽性病例,其診斷的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度分別為70.83%(51/72)、100%(34/34)、100%(51/51)、61.82%(34/55)和80.19%(85/106)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,RNAscope技術(shù)診斷肺結(jié)核的特異度和陰性預(yù)測值高于qRT-PCR法,敏感度、陽性預(yù)測值和準(zhǔn)確度低于qRT-PCR法,兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05,表2)。

表2 RNAscope技術(shù)與qRT-PCR法檢測的效能分析

圖2 qRT-PCR擴增結(jié)果呈S形擴增曲線：Ct值=23.92

圖3 RNAscope技術(shù)檢測顯示陽性位于壞死組織內(nèi),呈棕色細桿狀或顆粒狀

2.3 RNAscope技術(shù)與qRT-PCR法檢測的一致性確診組中兩種方法檢測均陽性者49例,qRT-PCR檢測陽性而RNAscope技術(shù)檢測陰性者9例,qRT-PCR檢測陰性而RNAscope技術(shù)檢測陽性者2例。對照組中qRT-PCR檢測2例陽性,均為結(jié)節(jié)病;RNAscope技術(shù)檢測未見陽性病例。一致性分析顯示,qRT-PCR與RNAscope技術(shù)檢測一致性較好(Kappa值=0.756,表3)。

表3 RNAscope技術(shù)與qRT-PCR法檢測的一致性比較

3 討論

結(jié)核病是以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacturium tuberculosis complex, MTBC)引起的傳染性疾病,肺是其主要靶器官。雖然典型的結(jié)核結(jié)節(jié)或壞死性肉芽腫性炎高度提示結(jié)核病,但受感染菌量和自身免疫力的影響,有時較難呈現(xiàn)典型的組織學(xué)改變,且其他細菌、真菌感染也可呈肉芽腫、壞死改變。因此,結(jié)核桿菌的病原學(xué)檢測至關(guān)重要[4]。結(jié)核病的主要病原學(xué)檢測方法有抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、基因檢測[5],qRT-PCR檢測價格低廉、敏感性高,已成為檢測結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用最廣泛的方法[4]。Babafemi等[6]對46項相關(guān)研究進行Meta分析,結(jié)果顯示qRT-PCR檢測肺內(nèi)結(jié)核病標(biāo)本的敏感度為82%,與本實驗敏感度(80.56%)相符;特異性(99%)比本實驗(94.12%)高,可能與本實驗樣本量較小有關(guān)。Wei等[7]進行Meta分析顯示,qRT-PCR對肺內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的檢測同樣具有較高的敏感性(92%)和特異性(96%),并指出高質(zhì)量的標(biāo)本和IS6110靶向序列的檢測是提高檢出率的關(guān)鍵。假陰性可能與樣本量不足、標(biāo)本含菌量少、DNA的降解或PCR抑制劑相關(guān)[8]。本實驗中有2例結(jié)節(jié)病患者qRT-PCR檢測的Ct值分別為39.09、39.54,經(jīng)重復(fù)檢測Ct值分別為38.97、39.05,并見S形擴增曲線判為陽性,但結(jié)合患者臨床信息,最終仍診斷為肺結(jié)節(jié)病。國內(nèi)有文獻總結(jié)約20%的結(jié)節(jié)病經(jīng)結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測可呈陽性,但具體發(fā)病機制尚不明確[9]。Zhou等[10]應(yīng)用RT-PCR對104例結(jié)節(jié)病標(biāo)本進行結(jié)核分枝桿菌檢測,發(fā)現(xiàn)20例陽性,但其DNA載量均較低,并提出以1.14×103copies/mL作為結(jié)節(jié)病與結(jié)核病鑒別的定量截斷值。Casallas-Rivera等[11]對胸膜結(jié)核進行qRT-PCR檢測中,在間皮瘤、間皮增生標(biāo)本中陽性。因此,如qRT-PCR結(jié)果與臨床診斷截然相反時,不能僅采取qRT-PCR檢測作為最終診斷,還需結(jié)合其他靶點或方法檢測。

RNAscope是一種新穎的RNA原位雜交技術(shù),利用獨特的探針設(shè)計和雜交的信號放大系統(tǒng),在單個細胞中實現(xiàn)單分子的原位可視化,不僅彌補傳統(tǒng)PCR法對組織的破壞,而且也避免非目的基因感染。RNAscope探針是結(jié)核分枝桿菌較為獨特的堿基序23S rRNA,與其他相似分枝桿菌堿基序列存在差異,為檢測和鑒定提供較好的目標(biāo)[12]。本實驗顯示RNAscope技術(shù)對肺結(jié)核分枝桿菌檢測的特異度為100%和敏感度為70.83%,與qRT-PCR法相比,其特異度、陽性預(yù)測值較高,敏感度、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度略低,但兩種檢測差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Rodriguez等[13]應(yīng)用RNAscope技術(shù)檢測人體結(jié)核病石蠟包埋組織同樣具有較高敏感性,并可特異性的區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌。Robertson等[14]報道RNAscope技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌RNA敏感性較高,并利用雙探針定量分析顯示干酪樣壞死區(qū)核酸復(fù)制速度比周圍組織減慢。有文獻報道RNAscope技術(shù)敏感性低于qRT-RCR,原因可能有以下幾個方面:(1)菌量極少,部分活檢組織可能在qRT-PCR切片檢測后再行RNAscope技術(shù)檢測,所剩組織小、含菌量少。(2)患者病情處于隱匿期或靜止期,結(jié)核分枝桿菌為自我保護將23S rRNA裂解,逃避機體免疫,難以被檢測[15]。(3)設(shè)計探針不同,IS6110為多拷貝基因,23S rRNA為單拷貝基因,通常單拷貝基因檢測靶標(biāo)敏感性低于多拷貝基因檢測靶標(biāo)。因此,RNAscope檢測石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌具有較高的敏感性和特異性,有助于原位觀察組織病理形態(tài),協(xié)助肉芽腫性病變的診斷與鑒別診斷。

本組采用RNAscope檢測72例肺結(jié)核病石蠟標(biāo)本有51例陽性,陽性信號多集中于壞死或與類上皮細胞交界處,結(jié)核分枝桿菌易出現(xiàn)在壞死區(qū)域或與其相鄰的類上皮細胞中,與文獻報道一致[16],提示在進行分子檢測時應(yīng)選擇典型結(jié)核結(jié)節(jié)或壞死性肉芽腫區(qū)域較多的蠟塊。研究顯示,結(jié)核分枝桿菌RNA的含量隨細菌活性減低或死亡而減少[17]。因此,RNAscope技術(shù)切片陽性信號的密度可能在某種程度反映患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的活性狀態(tài),有助于患者的診斷和治療。雖然結(jié)核分枝桿菌DNA分子檢測對結(jié)核病的定性較為實用,但是在區(qū)分死菌和活菌時效果較差,甚至體內(nèi)殘存溶解或受損的DNA片段仍可進行檢測[16],提示Ct值的大小不能直接代表患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的活性狀態(tài)。RNAscope檢測比qRT-PCR更加直觀,在不破壞組織完整性的同時,低倍視野即可獲得明確陽性信號,也便于資料存檔。

目前結(jié)核耐藥仍是影響結(jié)核病預(yù)后的主要因素,雖然本組未進行結(jié)核耐藥的相關(guān)檢測,但有文獻報道耐藥、藥物治療相關(guān)機制與23S rRNA基因密切相關(guān)。RNAscope技術(shù)可在同一張切片進行多基因檢測[2],其在結(jié)核分枝桿菌、耐藥相關(guān)檢測中有較好的應(yīng)用價值。本實驗為國內(nèi)首次應(yīng)用RNAscope技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌23S rRNA進行檢測,結(jié)果顯示敏感度、特異度較高,其在臨床應(yīng)用的前景較好。