花椰菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

邊立娜　牛國保　孫德嶺

摘 要：綜述了利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)新花椰菜種質(zhì)資源的研究及進(jìn)展、胚胎發(fā)生的影響因素及前景展望。

關(guān)鍵詞：花椰菜；小孢子培養(yǎng)；種質(zhì)創(chuàng)新

中圖分類號：S635.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.002

花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis L.）在我國栽培歷史較短，十九世紀(jì)中葉傳入我國南方，其種質(zhì)資源是國家和人民的寶貴財(cái)富，是培育優(yōu)良品種不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生物學(xué)理論研究的重要材料。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與我國蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，花椰菜種植面積快速增長，品種需求量急劇增加，從自然形成的品種中進(jìn)行選育的方法已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的需求。因此，加快花椰菜新品種選育、提高育種技術(shù)、創(chuàng)新種質(zhì)資源是花椰菜育種工作的當(dāng)務(wù)之急[1-3]。筆者僅就利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)新花椰菜種質(zhì)資源的研究及進(jìn)展作一簡單介紹。

1 創(chuàng)新花椰菜種質(zhì)資源的重要性與迫切性

花椰菜種質(zhì)資源系統(tǒng)性的整理、評價(jià)、鑒定工作在我國還處于初級階段，花椰菜育種研究薄弱，這是因?yàn)槲覈P(guān)于花椰菜的研究起步較晚，而且從事花椰菜育種研究的單位較少，研究力量薄弱，與其他蔬菜育種相比存在一定距離。

我國花椰菜種質(zhì)資源主要集中分布在福建省、浙江省、廣東省及上海市，由于種植地比較集中，種質(zhì)資源遺傳背景狹窄，花椰菜品種單一、品種間遺傳相似性高[1，4]。因此，在花椰菜育種工作中，創(chuàng)新種質(zhì)資源，選育出適應(yīng)不同栽培環(huán)境及市場需求的新品種是十分迫切的。

2 小孢子培養(yǎng)技術(shù)在花椰菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用

小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于花椰菜種質(zhì)創(chuàng)新的優(yōu)越性體現(xiàn)在3個(gè)方面。

（1）可以得到高度純合、穩(wěn)定的親本。游離小孢子培養(yǎng)是將花粉培育成單倍體植株，其染色體是自然或人工加倍得到純合二倍體的一種育種方法。這種染色體加倍產(chǎn)生的純合二倍體，在遺傳上非常穩(wěn)定，不發(fā)生性狀分離，形成性狀穩(wěn)定一致的近等基因系，為遺傳育種研究提供良好的育種材料[4-5]。同時(shí)，高純度的植株更便于遺傳分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記等基礎(chǔ)研究。

（2）應(yīng)用這一技術(shù)，能縮短育種年限，加速育種進(jìn)程。常規(guī)的親本獲得途徑是通過自花授粉和定向選擇，需經(jīng)6～8代，時(shí)間長，花椰菜多為自交親和。而通過小孢子培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的材料，進(jìn)一步用于育種實(shí)踐，大大縮短了育種年限[4]。

（3）可提高誘變育種的效率[5]。在誘變育種中，基因突變的機(jī)率很低，如果突變的是一個(gè)隱性基因，植株上不能直接表現(xiàn)出來，而以單倍體植物作誘變材料，突變隱性基因就可表現(xiàn)出來。所以利用單倍體植株的突變能夠篩選抗病、抗蟲、抗旱的高產(chǎn)花椰菜植株。

3 影響花椰菜小孢子胚胎發(fā)生因素的研究

3.1 不同花椰菜基因型對胚胎誘導(dǎo)的影響

基因型是影響小孢子培養(yǎng)的最關(guān)鍵因素。不同基因型植株在同樣的試驗(yàn)條件下，小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率差異很大[6]。方淑桂等[7]在相同條件下利用80份供試材料的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，只有20個(gè)產(chǎn)生胚狀體。趙前程等[8]對參試的186個(gè)試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，僅有55個(gè)材料得到了小孢子胚，出胚率為29.7%。張曉芬等[2]在對12個(gè)供試品種的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了基因型對胚胎誘導(dǎo)的關(guān)鍵作用。

3.2 供體植株小孢子胚發(fā)育階段

能否誘導(dǎo)小孢子發(fā)育成胚與小孢子發(fā)育階段息息相關(guān)。Sato等[9]研究指出，單核靠邊期和雙核早期是適宜小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期。在與花椰菜同屬十字花科的大白菜游離小孢子培養(yǎng)中，單核后期是誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)育的最佳時(shí)期[9]。方淑桂等[7]和星曉蓉[10]的研究結(jié)果都表明，在花椰菜小孢子培養(yǎng)中，只有單核晚期至雙核期的小孢子才能發(fā)育成胚狀體。此時(shí)花蕾長度為4.6～5.5 mm，此間產(chǎn)胚率最高，平均每蕾可產(chǎn)蕾約30個(gè)。而處于單核早期和三核期的小孢子一般不會膨大[7，11]。

3.3 花椰菜供體植株和花粉的生理狀態(tài)

受栽培環(huán)境、花期及其花蕾生理狀況的影響，誘導(dǎo)小孢子成胚率不同。在對十字花科作物的研究中，張鳳蘭等[12]利用人工氣候室研究了不同光照和溫度對小孢子胚胎發(fā)生的影響，結(jié)果表明： 日照時(shí)數(shù)為14 h、溫度在15～20 ℃最有利于小孢子胚的發(fā)生，此時(shí)產(chǎn)胚率最高。高溫短日照對小孢子最為不利。李浩杰等[13]在對甘藍(lán)類油菜小孢子培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，晝夜溫差5 ℃左右時(shí)胚產(chǎn)量最高，溫度低于5 ℃或高于20 ℃胚產(chǎn)量都較低甚至不出胚。顧宏輝等[14]在對早熟花椰菜小孢子的研究中也發(fā)現(xiàn)，早熟花椰菜中，適宜小孢子胚胎發(fā)育的最佳時(shí)期較少，這與其生長環(huán)境可能存在一定關(guān)系。

3.4 高溫處理

高溫?zé)峒ゎA(yù)處理是促進(jìn)細(xì)胞對稱分裂、改變小孢子發(fā)育方向的主要條件[15-17]。許多研究表明，甘藍(lán)類小孢子培養(yǎng)初期不經(jīng)過高溫處理，培養(yǎng)無反應(yīng)，而經(jīng)過高溫處理的，因溫度和處理時(shí)間不同，胚產(chǎn)量高低也有差異。方淑桂等[7，11]對花椰菜游離小孢子的研究表明，33 ℃下處理48 h效果最好，產(chǎn)胚量明顯高于其他處理。趙前程等[8]對花椰菜小孢子高溫處理研究表明，32 ℃下，處理24 h效果最佳。

3.5 培養(yǎng)液對胚狀體發(fā)生的影響

NLN培養(yǎng)基是花椰菜游離小孢子培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。方淑桂等[7]在游離花椰菜小孢子培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中19%蔗糖濃度下，小孢子存活率最高，而在13%蔗糖濃度下，誘導(dǎo)成胚率最高，因此，添加和更換培養(yǎng)液對胚狀體的影響非常重要。趙前程等[8]研究表明，在培養(yǎng)基中添加6-BA 0.1 mg·L-1和NAA 0.005 mg·L-1的激素組合，能促進(jìn)小孢子胚狀體的發(fā)育，形成球型胚的發(fā)生頻率最高。

3.6 不同日齡對胚狀體的影響

花椰菜小孢子胚狀體發(fā)育比較緩慢，離體培養(yǎng)20 d后，發(fā)育成球型胚，此時(shí)應(yīng)將胚狀體轉(zhuǎn)移到脫分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出愈傷組織后再進(jìn)行誘導(dǎo)分化，就能夠獲得高效率的植株再生。趙前程等[8]試驗(yàn)表明，不同日齡的胚狀體進(jìn)行脫分化處理的成活率不同，20 d的胚狀體成活率最高。

4 培養(yǎng)技術(shù)

4.1 分離小孢子的方法

目前分離小孢子的方法有兩種：（1）自然散落法。即將處于小孢子成胚發(fā)育最佳時(shí)期的花蕾清洗消毒后，在無菌的條件下，取出花藥，接種在培養(yǎng)基上，任其花粉散落。（2）機(jī)械擠壓法。將用酒精和次氯酸鈉消毒后的花蕾置于研缽中，用研磨棒將花粉擠壓出來，用尼龍網(wǎng)過濾，再用B5培養(yǎng)基沖洗，經(jīng)過多次離心，得到游離小孢子[18-19]。

4.2 培養(yǎng)基及其附加物

在花椰菜小孢子培養(yǎng)中，一般采用蔗糖濃度為13%的NLN培養(yǎng)基，趙前程等[8]研究表明，在培養(yǎng)基中添加6-BA 0.1 mg·L-1和NAA 0.005 mg·L-1的激素組合，能促進(jìn)小孢子胚狀體的發(fā)育，形成球型胚的發(fā)生頻率最高。小孢子在發(fā)育過程中，會釋放有毒物質(zhì)，這些有害物質(zhì)會降低小孢子胚狀體的成活率。楊清等[19]報(bào)道，在冬花椰菜的小孢子培養(yǎng)過程中，加入0.5 g·L-1的活性炭能提高胚的發(fā)生率。Dais和Martins[20]在花椰菜小孢子培養(yǎng)過程中，加入AgNO3 能夠促進(jìn)胚胎的形成。

4.3 高溫預(yù)處理

將培養(yǎng)基放置在高于正常溫度的條件下，進(jìn)行熱激處理。一般認(rèn)為33 ℃下預(yù)處理24 h，轉(zhuǎn)入24 ℃下培養(yǎng)，出胚率較高。此外，花粉密度對小孢子的培養(yǎng)也非常重要。Duijs[21]研究表明，小孢子密度為2×104～4×104個(gè)·mL-1最適合。

4.4 植株的再生

小孢子培養(yǎng)3 d左右將發(fā)生第一次分裂，2～3周后依次出現(xiàn)球型胚和心形胚，繼續(xù)培養(yǎng)，將出現(xiàn)子葉胚，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上發(fā)育成植株。經(jīng)小孢子培養(yǎng)得到的是單倍體植株，經(jīng)化學(xué)試劑如秋水仙素處理，或者田間自然加倍，可得到純合二倍體。而趙前程等[8]研究結(jié)果表明，在花椰菜小孢子的培養(yǎng)過程中，存在較高頻率的自然加倍，認(rèn)為經(jīng)花椰菜小孢子培養(yǎng)得到的再生植株，不需要進(jìn)行人工加倍，其具有自然加倍成二倍體的特點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)，使利用小孢子培養(yǎng)得到純和親本的育種工作變得更加快捷。

5 前景與展望

經(jīng)過多年的研究探索，我國花椰菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)逐漸完善，應(yīng)用于育種工作取得重大突破與成功。但利用小孢子發(fā)育成胚狀體誘導(dǎo)率不高，添加適當(dāng)?shù)募に乜梢蕴岣咭壮雠叩漠a(chǎn)胚率，但是尚未找到促使難出胚材料出胚的激素配比[22]。關(guān)于小孢子培養(yǎng)的啟動機(jī)制、微觀發(fā)育機(jī)制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的理論研究僅在猜測和探究過程中[23]，基因型影響出胚率是毋庸置疑的，但如何克服這一困難，在分子與蛋白質(zhì)水平上還有待研究，應(yīng)該加強(qiáng)小孢子培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞工程、基因工程等其他生物技術(shù)的結(jié)合[18]。不斷完善小孢子培養(yǎng)技術(shù)，同時(shí)探究其理論基礎(chǔ)，使這項(xiàng)技術(shù)能更好地為我們所利用。

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