新疆喀什地區石榴冠癭病的發生及其病原鑒定

日孜旺古麗·蘇皮　王麗麗　李克梅　阿不都克尤木　李超

摘 要：為了確定石榴冠癭病的病原菌，對新疆喀什地區疏附縣石榴冠癭病的發生危害進行了調查。通過采用病原菌分離、鑒定，并通過快速接種番茄誘導使根莖產生腫瘤等方法，明確了石榴冠癭病的病原菌為Agrobacterium tumefaciens（Smith and Townsend）Conn.。石榴冠癭病是國內新發生的病害，應該嚴格檢疫。

關鍵詞：石榴；冠癭病；病原菌

中圖分類號：S665.4；S436.6 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.015

果樹冠癭病（Crown gall disease）又稱根癌病、根瘤病，是多種果樹共患的一種重要的根部病害。陜西、山西、甘肅、遼寧、河北等省（區）都有分布，寄主范圍廣泛，主要包括李屬、薔薇屬、蘋果屬、梨屬、胡桃屬、葡萄屬等331屬的640個不同種植物。感病植物根系出現瘤狀癌變，地上部分生長緩慢，枝條干枯甚至枯死，對苗木和幼樹影響很大[1-6]。近年來，由于果樹、經濟林木等栽培業迅速發展，苗木調運頻繁，此病在新疆有繼續發展擴大蔓延的趨勢，是一種急需控制的危險性病害[7]。

冠癭病是一種細菌性病害。德國科學家經過多年研究發現了冠癭病的成病機理。冠癭病是一種由根瘤農桿菌引起的在多種植物中廣泛傳播的病害，患病植物的一些部位，尤其是根莖接合部形成腫瘤狀膨大，造成果樹減產[8]。據我們調查，在2009年喀什地區疏附縣石榴種植區發生了石榴冠癭病。經查閱文獻，在我國還無人對石榴冠癭病進行過研究的報道，為此我們于2010年5—10月和2011年5—10月對喀什石榴冠癭病病害的發生危害情況及對病原菌進行了分離培養鑒定，為病害的有效治理提供科學基礎。

1 材料和方法

1.1 果園石榴冠癭病發病率調查

2010年5—10月、2011年5—10月連續2年，對新疆喀什地區疏附縣石榴基地冠癭病發生情況，進行了專項調查。

1.2 病原菌的分離、培養、鑒定

1.2.1 供試培養基 PDA培養基、牛肉膏蛋白胨培養基。PDA培養基的成分：馬鈴薯200 g，葡萄糖10～20 g，瓊脂17～20 g，水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨培養基的成分：牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，瓊脂15 g，水1 000 mL。

1.2.2 分離方法 從果園發病的果樹枝條瘤狀物處，刮去表皮角質層，留取木質部以上瘤狀皮層和木質部，切取至綠豆大小。經處理后的病樣通過以下程序消毒滅菌：75%酒精浸泡5～10 s，取出置5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后，依次在無菌水中清洗3，5，3 min。搗碎皮層組織和木質部，分別劃線接種于PDA和牛肉膏蛋白胨培養基上，25 ℃培養3 d后純化，觀察其培養特性，再進行革蘭氏染色。

1.2.3 純化及革蘭氏染色[9] 將培養出的病原菌接種至鋪好的培養皿中，倒扣放置。待接種程序完成后，把接種好的培養皿放置于25 ℃下的溫箱中培養，3 d后開始記錄生長菌落。將生長出的病原菌涂片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌于干凈的載玻片上涂布均勻，固定。草酸銨結晶紫染1 min。自來水沖洗，去掉浮色。用碘-碘化鉀溶液媒染1 min，傾去多余溶液。用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30 s，油鏡觀察。

1.2.4 病原菌的致病性測定 選用番茄做為指示植物。在室內條件下，用番茄消毒種子培養苗長到8 cm高時，采用根莖注射的方法用滅菌注射器接種病菌懸液，以接無菌水為對照，共接種20株，每株3個接種點，套袋保濕培養24 h后去掉保鮮袋。第3天開始觀察記錄，10 d后統計腫瘤發生情況。參考細菌鑒定方面的資料，結合接種誘導對病原菌進行鑒定[10]。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

石榴冠癭病主要危害枝條、根莖部等。在危害部位形成大小不一的瘤狀物，初期幼嫩，質地柔軟，逐漸增大成不規則形狀，其后在大瘤上又出現許多小瘤，表面粗糙并龜裂，顏色發綠，到后期瘤的內部組織紊亂，瘤邊緣長出許多絲狀物（圖1）；得病后的植株生長衰弱，葉黃而且小，新梢生長不良，甚至枯死（圖2）

2.2 病原菌的分離鑒定

分別用牛肉膏蛋白胨培養基和PDA培養基用稀釋分離法培養[11]，在牛肉膏蛋白胨培養基上主要長出細菌菌落，5個培養皿上共長出650個菌落。在皮層組織中分離出607個菌落；木質部和表皮很少，共分離出43個菌落。根據菌落特征將其歸為2種：但以菌株1為優勢細菌，在牛肉膏蛋白胨培養基上，菌落小而圓，白色，稍突起，濕潤半透明，菌體桿狀，平均大小0.6×2.0 μm，革蘭氏染色反應陰性。結果見表1。

2.3 病原細菌的致病性測定

將石榴枝條瘤狀物上分離純化后的菌株1，接種到8 cm高的盆栽番茄幼苗根莖上，誘發腫瘤迅速形成，再從誘發的腫瘤上分離出與原先接種的相同菌。結果見表2。接種組與對照組有較明顯的差異。

3 結論與討論

通過對石榴冠癭病的癥狀觀察，病原分離培養，接種誘導相結合的方法，確定引起新疆喀什地區疏附縣石榴冠癭病的病原，是野桿菌屬的根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens （Smith and Townsend）Conn，與文獻報道的果樹冠癭病的致病菌特征相一致。從分離部位來看病，瘤皮層中分離細菌數量多，木質部和表皮很少。

該病原菌在石榴上的危害在全國尚屬首次報道，危害性很強，可以導致石榴樹干枯，從而造成巨大的經濟損失，應該引起高度重視。石榴產地發現病株應立即挖出集中燒毀。無病區不宜從病區引進苗木，調運檢疫中發現病苗應該銷毀。對可疑苗木出圃時，用硫酸銅浸泡5 min，再用生石灰50倍液浸泡1 min，并用清水沖洗。

對輕度病株可將病瘤切除，用80%抗菌劑402乳油50倍液消毒，外涂波爾多液保護。可以消除病瘤。

參考文獻：

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