葫蘆科作物功能基因組學研究進展

趙勝杰　路緒強　朱紅菊等

摘 要： 近些年，植物基因組學研究發展迅速，已進入功能基因組研究的新階段，一些新的技術和方法不斷涌現。西瓜、甜瓜和黃瓜是葫蘆科重要的經濟作物，其功能基因組學研究雖然起步較晚，但也取得了初步成果。綜述了近幾年植物功能基因組學主要研究方法如表達序列標簽（EST）、TILLING技術、DNA芯片和RNA干涉（RNAi）等在西瓜、甜瓜和黃瓜上的應用概況，并展望了未來葫蘆科作物功能基因組研究的發展趨勢。

關鍵詞： 功能基因組； 西瓜； 甜瓜； 黃瓜

功能基因組學（functional genomics），又被稱為后基因組學（post-genomics），它是利用結構基因組學提供的豐富信息和產物，借助高通量、大規模的試驗分析方法，在全基因組或系統水平上研究基因的功能，弄清生物體中各組分是如何工作并形成有功能的細胞、組織及整個生物體[1]。其目標是明確基因組中全部基因的功能， 揭示植物生長發育、環境應答互作的分子網絡， 從而全面闡釋植物的生物學基礎。目前，水稻、擬南芥等模式植物功能基因組學研究發展較快，近幾年隨著科技進步和資金投入的不斷增加，葫蘆科作物基因組研究也取得了一定的成果。西瓜基因組全長約425 Mb，甜瓜約450 Mb，黃瓜約376 Mb[2]， 基因組大小比較適合開展基因組測序和功能基因組研究。2007年由西班牙牽頭組織，美國、中國、法國、以色列、日本等國家的14個實驗室聯合啟動了國際葫蘆科基因組計劃（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），該計劃為瓜類蔬菜的基因組學研究奠定了良好的技術平臺。在此基礎上，2008年相繼啟動了葫蘆科三大作物西瓜、甜瓜、黃瓜的全基因組測序計劃[3]。隨著基因組測序工作的陸續完成，瓜類作物基因組研究逐步進入到功能基因組研究時代。本文綜述了近些年植物功能基因組學主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黃瓜上的應用概況。

1 高通量、大規模EST測序及功能解析

EST（Express Sequence Tag）是指通過對cDNA 文庫中隨機挑取的克隆進行大規模測序所獲得的cDNA 的5或3端序列，長度一般為150～500 bp。EST是基因編碼序列的一部分，通過與數據庫中已知功能的基因序列進行對比，從理論上可推測其基因功能。EST已發展成為新基因發現的有效途徑，也是植物功能基因組學研究的重要工具。隨著測序技術的不斷改良和測序成本的降低，高通量、大規模EST測序及功能解析開始廣泛應用。

西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構建了西瓜果實發育不同時期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫，獲得了832條無冗余EST，序列比對分析表明有410個EST-unigenes與已知編碼蛋白的基因同源，按功能歸類分屬于初級代謝、氨基酸合成組裝、細胞膜運輸、細胞分裂、細胞壁代謝、細胞骨架和細胞形成、基因轉錄和表達、信號轉導、抗性防御和次級代謝。這些潛在的功能基因序列為日后開展西瓜果實發育和品質形成的遺傳與功能基因組研究奠定了基礎。呂桂云等[5]通過構建枯萎病菌誘導的西瓜根系組織SSH-cDNA文庫，對測序獲得的4 431條高質量EST序列進行聚類拼接，獲得1 756個非重復序列，基因功能分類表明抗病與防御相關基因約占36.3%，對獲得的西瓜與枯萎病非親和互作中部分特異性表達的基因進行了初步探討，發現可能參與西瓜與枯萎病菌非親和互作的轉錄因子、激酶和防衛基因及茉莉酸和木質素2個主要代謝途徑。Guo等[6]采用Roche/454新一代測序技術，從西瓜4個果實發育期（授粉后10、18、26、34 d）獲得了577 023個高質量EST，組裝成了75 068個unigenes，有54.9% 的unigenes與GeneBank中的已知基因同源，其中2/3來源于黃瓜。Gene Ontology （GO）注釋表明，有33 853個unigenes（45.1%）獲得至少1個GO術語，被注釋序列的基因功能分屬于分子功能（molecular function）類別、生物過程（biological process）類別和細胞組分（cellular component）類別，所占比例分別為38.6%、38.6%和36%，另外大約29%的unigenes同時具有以上3種功能分類。生物過程類別的基因主要參與細胞過程、代謝過程和生物合成過程，表明果肉組織在發育過程中發生了廣泛的代謝活動。數字基因表達譜分析及實時定量PCR驗證表明有3 023個基因在果實發育不同時期存在顯著的表達差異，表達量差異至少在2倍以上。研究發現細胞壁相關基因在未成熟白瓤果肉組織中高效表達，而類葫蘆卜素代謝基因（八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素-β環化酶）、蔗糖代謝基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果實發育不同時期差異表達明顯，作者對與果實品質相關的一些生化途徑如纖維素合成、木栓質合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等進行了進一步鑒定。

甜瓜大規模EST測序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通過構建甜瓜EST數據庫，從4 800條序列中鑒定出與甜瓜果實香味代謝相關的3類基因家族，乙醇乙酰轉移酶、倍半萜合酶和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，克隆得到候選基因的全長序列，研究了這些基因在不同甜瓜品種間的表達模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通過對8個來源于甜瓜不同組織和生理狀態的cDNA文庫（包括授粉后15 d和46 d的2個果實的文庫）測序和序列拼接、組裝，獲得16 637個無冗余EST。通過與擬南芥基因組做生物信息學比對分析，發現眾多個與果實發育相關的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、細胞壁代謝酶、類胡蘿卜素合成代謝酶、MADS-box 基因等。實時定量PCR表明在果實成熟期乙烯受體基因EIN4表達量翻倍，表明該基因與果實成熟期乙烯信號調控相關。MADS-box 基因SVP在果實成熟期表達量下降了4倍，番茄紅素ε環化酶基因（LUT2）和木葡聚糖內糖基轉移酶基因（TCH4）表達量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]構建了4個不同類型甜瓜品種不同植物組織的11個全長cDNA文庫和4個標準化cDNA文庫，分別獲得71 577 條和22 179條EST，能夠組裝成24 444條unigenes，基因對比顯示有75%～85%的序列與雙子葉植物同源，70%與單子葉植物同源，有6 972個基因家族在雙子葉植物和單子葉植物間具有保守性。對數字基因表達譜研究，結果表明有175個基因為組織特異表達，這些基因為未來開展功能基因組研究提供了寶貴的資源。作者從這些序列中鑒定出了4 068個SSR和3 073個SNP，并對1 382個全長轉錄組進行了分析。為了解甜瓜對鹽脅迫的抗性反應機制，Shiwei Wei等[10]構建了耐鹽甜瓜品種根系組織的抑制消減雜交（SSH）cDNA文庫，測序獲得262條uni-ESTs，有161條序列與已知基因高度同源，128條與未知功能基因同源，有很多基因顯示與生物和非生物脅迫相關。研究表明，甜瓜耐鹽受眾多蛋白質調控，這些蛋白涉及細胞代謝、能量、轉錄、信號轉導、蛋白質命運以及細胞拯救和防御等生物過程，表明甜瓜作物耐鹽存在復雜的抗性反應機制。

在黃瓜上面，Dae-Jae Kim[11]構建了黃瓜子葉生長不同時期的cDNA文庫，篩選出大量與衰老相關的基因，利用半定量RT-PCR分析了365個克隆，發現有很多基因表達量提高，這些基因有些功能已知，有些功能未知。齊曉花等[12]采用SMART 技術構建了高抗白粉病的黃瓜品系JIN5-508 的葉片cDNA文庫，利用該文庫隨機挑選的8 352個克隆從5端進行單向測序，共獲得8 035個有效的ESTs，序列的平均長度為838 bp。從文庫中篩選出了大量的低豐度表達基因，約占unigene總數的72.5%，1 991個unigenes 獲得分子功能注釋，其中與蛋白結合活性和催化活性相關的基因分別達到了41.34%和38.72%；在獲得功能注釋的unigene 中，有部分抗病抗逆相關基因高豐度表達，其中3個unigenes與擬南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消減雜交技術（SSH）構建黃瓜胚胎發育早期和晚期差異表達cDNA文庫，經反向Northern blot雜交檢測，共得到97個陽性克隆。利用分子生物學軟件對測序后的序列進行質量檢測和聚類、拼接，共得到93個Uni-ESTs，其中包括86個singletons 和7個contigs。將上述EST序列在GenBank上進行BLAST比對，有83個EST片段找到了與之匹配的同源序列，有10 個EST片段未找到同源序列，推測可能是新基因。其中很多EST與擬南芥、水稻或玉米蛋白質數據庫中的熱激蛋白具有很高的同源性。將以上序列進行功能分類，發現在胚胎發育早期細胞防御和代謝過程占主要位置，而在胚胎發育晚期細胞防御和抗滲透脅迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黃瓜全雌系和雌雄同株系測序獲得353 941條EST，其中188 255條來源于全雌花，165 686條來源于雌雄花，結合5 600條GeneBank收錄的EST和mRNA序列，組裝成了81 401條unigenes。通過基因功能注釋和分析，預測了343個生化代謝途徑。對數字基因表達分析，表明大約200個基因在不同花性型存在差異表達，為研究植物花分化的分子機理提供了新的認識。潘宇等[15]構建了黃瓜授粉前后多個發育階段的幼果組織cDNA文庫，測序獲得116條EST，92.2% 的長度在400 bp以上，19% 為重疊序列。在GeneBank中進行BLAST分析后確認與已知功能基因相似的EST序列有71條，有相似序列而功能未知的基因和沒有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。

2 TILLING技術

TILLING（targeting induced local lesions in

genomes，定向誘導基因組局部突變技術），該技術借助高通量、標準化的檢測手段，快速有效地從經化學誘變劑（EMS）誘變過的突變群體中鑒定出點突變。與傳統的插入突變比，TILLING技術利用傳統的化學誘變獲得突變體，不需要耗時的轉基因和復雜的組織培養過程，具有高通量、低成本、高效率等諸多優勢。目前，TILLING作為一種全新的反向遺傳學研究方法已經用于多種植物。

TILLING技術在葫蘆科作物上的應用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS誘變構建了甜瓜品種Noy Yizreel的突變基因庫，共產生3 000個M2家系，發現了大量新的表型突變，大部分為隱性單基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品種Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技術平臺，CharMono系雌雄同株、呼吸躍變型，在M2代發現了大量子葉、莖蔓、花和果實發生的表型突變，利用與果實品質相關的11個基因篩選突變株系，發現大約每隔573 kb會發生一個突變，大部分都是G/C 突變成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的變異，外顯子測序表明31.3%為基因沉默突變，65.1%為錯義，2.4%為轉錄終止，1.2%為拼接剪接突變，氨基環丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1篩選到7個獨立的點突變，其中G194D果皮顏色變異明顯，果實延遲成熟黃化，而果形、可溶性固形物含量和果肉顏色仍然與野生型一樣。G194D自交純合株系也呈現出果實發育期延長、果肉變硬和果實延熟，并且在2個不同試驗地點表現一致，這些表型變異證明了G194D系CmACO1基因突變而來，該研究利用TILLING技術成功創造了甜瓜品質新資源，顯著提高了品種貨架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品種Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技術平臺，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸躍變型，EMS誘變得到2 368個M2家系，用病毒侵染抗性相關的2個基因Cm-eIF4E（核細胞翻譯起始因子）、eIF（iso）4E（核細胞翻譯起始因子異構體）、4個與果實成熟相關的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脫氧羧腐胺賴氨酸合酶）以及PDS（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發現有4個Cm-eIF4E等位基因突變，推測其中的2個改變了蛋白質功能，PDS有2個等位突變，發生在外顯子的突變改變了蛋白質功能，造成了苗期白化表型突變。4個與果實成熟相關的基因在群體中篩選突變，得到8個突變的家系。徐美紅等[19]用PCR產物直接測序和克隆測序2種方法用于檢測這8個突變家系的堿基變化。在直接測序中，4個突變家系的測序結果清晰，能夠確認堿基的變化；其他4個家系的結果不清晰，不能確認堿基的改變。在克隆測序中，8個家系的測序結果均清晰，能夠直接確定目的基因的點突變。在2種方法的比較中，克隆測序的準確率、效率明顯優于直接測序法。

黃瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通過EMS誘變獲得了大約1 000個M2家系，在苗期發現了諸如植株矮化、子葉自發病變、黃（花）葉、白化苗、葉片卷曲、窄型黑色子葉等諸多表型突變，利用PDS-3（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發現了4個突變家系，測序表明堿基突變均發生于基因內含子區域，因此并未造成相應的黃化表型突變。該套突變體庫為黃瓜反向遺傳學及基因功能研究奠定了很好的基礎。

西瓜作物TILLING技術的應用尚未見正式報道，美國農業部蔬菜研究實驗室的科學家目前正在從事相關的工作，預計將很快取得進展。

3 DNA芯片

DNA芯片是利用已知基因組序列，或來自未知序列的 cDNA 克隆制備模板 cDNA，通過人工或特定的儀器將大量模板 cDNA 按設計好的順序定量地固定在載體上制備成高密度的微陣列。將標記好的樣品 cDNA 片段（來自不同細胞、組織或整個器官）與模板上的cDNA 進行分子雜交。根據不同材料間基因差異表達的信息，推論某個基因的功能或鑒定和分離目的基因。DNA 芯片還廣泛應用于基因表達譜、突變基因篩選和轉基因鑒別等方面。

在西瓜上，Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構建了西瓜果實發育不同時期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫。為進一步探究這些EST-unigenes在果實發育不同時期的轉錄表達差異，W. Patrick Wechter等[21]利用微列陣（microarray）技術對這些EST進行了差異表達分析，發現與葉片相比，有335個ESTs的表達存在明顯的差異，表達量差異至少在2倍以上。其中有211個與已知功能基因同源，96個為未知基因。這些基因參與了維管系統、類胡蘿卜素合成、轉錄調控、病原和逆境脅迫響應以及乙烯合成等，實時定量PCR也驗證了這些功能基因的差異表達。

在甜瓜上，張紅等[22]利用國內首個甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0檢測了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果實基因表達以及經60Co射線輻射誘變后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病變異株成熟果實基因的表達。結果顯示，該芯片平均能夠檢測新疆厚皮甜瓜基因2 008個，檢測出的基因占該芯片基因探針總數的65.4%。發現酸味抗病變異株上調表達的基因有251個，占檢出基因總數的12.5%，下調表達的基因224個，占檢出基因總數的11.16%。RT-PCR重復試驗表明用Melon cDNA array ver 1.0檢測新疆厚皮甜瓜成熟果實基因表達水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花葉病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片檢測了17 443個unigenes的表達，發現接種感染后TGR-1551比對照發生了顯著的轉錄差異，與空白對照相比，Tendral有 3 291個unigenes 差異表達，TGR-1551有2 488個unigenes 差異表達，共有677個unigene unigenes受到抑制表達。說明TGR-1551發生了廣泛、深刻的轉錄差異。

在黃瓜上，毛偉華等[24]通過GenBank搜索已發布的生物代謝途徑中的關鍵酶基因序列， 設計特異性引物， 采用RT-PCR法擴增這些酶的相應基因片段，在完成432個基因片段的克隆分離、測序和生物信息學分析工作的基礎上研制出國內首張黃瓜cDNA 芯片。該芯片含有9個質控cDNA片段和423個cDNA探針， 涉及光反應、卡爾文循環、碳水化合物代謝、水-水循環、信號傳導、激素代謝、光呼吸、防御、蛋白與氨基酸代謝等多個代謝途徑。利用該芯片對黃瓜缺鎂脅迫下基因表達譜進行了初步研究， 發現在缺鎂脅迫下差異表達的22個基因， 其中10個基因的表達受缺鎂處理抑制， 12個基因的表達受缺鎂處理誘導。該芯片的研制為進一步研究黃瓜功能基因的高通量時空變化提供了有效的技術支撐。為驗證該套cDNA芯片雜交結果的可靠性，毛偉華等[25]研究了黃瓜在CMV 侵染脅迫下的基因表達譜變化，并對其中5個具有代表性的基因通過實時熒光定量PCR（QRT—PCR）進行檢測，共獲得67個差異表達顯著的基因，其中42個基因下調表達，25個基因上調表達。這些差異表達的基因涉及了許多重要代謝途徑，許多與光合作用、氮同化相關的基因受到明顯的抑制，而一些防御相關基因和信號傳導相關基因則誘導表達。同時，也發現了一些與CMV 脅迫相關的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究發現，CMV 脅迫引發了黃瓜代謝發生一系列復雜的適應性變化，PR1-1a 等基因可能在黃瓜防御CMV侵染過程發揮著重要作用。

4 RNAi技術

RNAi（RNA interference）是一種雙鏈RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技術具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，根據表型變異可推測該基因的功能，RNAi已發展成為功能基因組學研究中基因功能鑒定的一種強有力的工具。

2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技術沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核細胞翻譯起始因子）基因，通過對轉基因T2代接種8種甜瓜易侵染的病毒，發現轉基因植株對黃瓜葉脈黃化病毒（CVYV）、甜瓜壞死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花葉病毒（MWMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）產生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜對這4種病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因對于甜瓜作物廣譜高抗等位基因的發現，將是一個有效的選擇途徑。程鴻等[27]通過RT-PCR 方法從甜瓜中克隆得到白粉病感病相關基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 結果表明，CmMLO2 主要在甜瓜葉片中表達，具有組織特異性。在受到白粉病菌脅迫時CmMLO2表達顯著上調，表明CmMLO2 很有可能與白粉病發病有關。構建RNAi表達載體，利用葉盤轉化法轉化甜瓜，獲得了PCR 陽性植株，對白粉病接種鑒定結果表明，轉化植株對白粉病具有抗性，證明通過ihpRNAi敲除CmMLO2，可以獲得對白粉病具有抗性的甜瓜材料。

5 T-DNA插入突變

T-DNA（transferred DNA）是根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）內 Ti 質粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并穩定地整合到植物基因組中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因組中的T-DNA 類似于給基因貼了一個序列標簽。通過分離T-DNA 標簽位點的側翼水稻基因組序列， 可以快捷地找到含有標簽的基因， 經過插入標簽基因與突變體表型的共分離檢測， 從而獲得基因的生物學功能。任海英等[28]采用農桿菌侵染子葉外植體的方法產生T-DNA 插入的甜瓜突變體，篩選到一個蔓枯病抗性明顯增強的突變體，命名為edr2，該突變體是T-DNA 單拷貝插入甜瓜染色體引起的，edr2 的蔓枯病抗性和標記基因卡那霉素抗性基因共分離。蔓枯病菌在突變體甜瓜edr2上的侵染過程與在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌發率降低、芽管的伸長和菌絲的生長較遲緩。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突變體發生細胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的細胞發生程序性死亡。本研究為選育抗蔓枯病的甜瓜品種提供了新的思路，為挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。

6 展 望

西瓜[29]、甜瓜[30]、黃瓜 [31]全基因組測序已完成并對外公布，測序獲得的大量生物信息為開展功能基因組學研究奠定了基礎，也標志著瓜類作物基因組研究逐步進入到功能基因組研究時代。可以預測，未來將會有更多不同類型的cDNA文庫，包括全長cDNA文庫被構建，更多的EST序列將被釋放，從而為基因芯片的開發提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突變體庫的構建工作也將陸續啟動或完成，更多的功能基因將被鑒定和分離。功能基因組研究的深入有望鑒定和分離出控制重要農藝性狀的全部基因， 揭示基因的時空表達模式，弄清在性狀形成中基因與基因的互作，并在此基礎上形成對基因調控網絡的認識。屆時人們就能夠從基因結構和基因表達調控兩個方面對基因進行修飾，在作物育種實踐中實現分子設計育種，從而培育出抗逆性強、品質優良、有益人體健康的西瓜、甜瓜、黃瓜品種，滿足人們不斷增長的消費需求。

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