金華火腿粗肽液的體外抗氧化活性

祝超智 張萬剛等

摘 要：在金華火腿長期加工過程中，蛋白質在內源酶作用下產生了大量不同長短的肽段。提取金華火腿粗肽液，通過測定不同質量濃度粗肽液清除自由基、螯合金屬離子、抑制脂質過氧化和蛋白質氧化的能力，并與相應質量濃度的丁基羥基甲苯（BHT）和谷胱甘肽（GSH）作比較，衡量金華火腿粗肽液的抗氧化能力。結果表明：隨著質量濃度的增加，金華火腿粗肽液的抗氧化能力顯著增加。在質量濃度為1.5mg/mL時，金華火腿粗肽液清除羥基自由基能力達到90%；質量濃度為5mg/mL時，金華火腿粗肽液清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力與BHT和GSH相當，高達95%；金華火腿粗肽液螯合金屬離子的能力顯著高于BHT和GSH；當質量濃度為4mg/mL時，金華火腿粗肽液具有和BHT和GSH相當的抑制脂質過氧化能力，并能一定程度抑制蛋白質氧化。結論：金華火腿粗肽液的抗氧化能力與BHT與GSH相當。

關鍵詞：金華火腿；粗肽液；清除自由基；螯合金屬離子；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）06-0005-05

金華火腿與如皋火腿、宣威火腿并稱中國三大知名火腿，是中國最著名的傳統肉制品之一。金華火腿不僅是著名的肉食品，而且具有重要的滋補和藥用功能。據記載[1]，金華火腿具有養老補虛、和中安神、開胃寬膈、益腎壯陽、生津血、固骨髓等滋補功能，可用于治療噎嗝、腹病、虛勞、虛痢、久瀉和婦女分娩后蓐勞等癥。至今在中國金華地區民間仍保留著用金華火腿作為滋補禮品饋贈親友及利用金華火腿治療腹瀉、蓐勞等疾病的習俗。

自由基是生物體新陳代謝過程中產生的一類具有高度氧化活性的帶有一個或幾個不配對電子的分子或原子，其化學性質相當活躍，會導致對生物體的破壞[2]。科學研究證明，氧自由基幾乎和人類大部分常見疾病都有關系，從人類死亡率最高的心腦血管疾病到癌癥，都和氧自由基有著密切關系[3]。同時，隨著現代食品工業的發展，當前采用的合成類抗氧化劑如丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）等雖然能抑制油脂氧化，卻帶來食品的安全性問題[4]。因此，近二十年來天然抗氧化劑有了蓬勃的發展，因其毒性小或無毒性且具有一定的保健功能而備受人們的青睞。一些天然抗氧化肽具有重金屬清道夫和過氧化氫分解促進劑的作用，可降低自氧化速率，減少脂肪過氧化氫含量，減少自由基的生成[5]。大豆蛋白是目前研究最深入的一種制備抗氧化肽的植物性原料；動物蛋白原料主要包括草魚、泥鰍等[6-7]。

傳統的金華火腿需要加工8～10個月，在此過程中，火腿中的肌肉蛋白質在肌肉內源蛋白酶的作用下產生水解，因此在火腿加工過程中，有大量多肽、小肽產生。Rodriguez等[8]對Sarrano火腿的研究表明，多肽組成可分為5個分子質量范圍，即4500～2700、2700～1200、1200～500、500～375u和375～160u。研究發現，在火腿加工過程中，2700u以下的多肽，尤其是1200u以下的多肽數量顯著增加，而4500～2700u的多肽數量下降。Flores等[9]發現，在Serrano火腿加工過程中二肽如肌肽和鵝肌肽含量增加。Sforza等[10]對帕爾瑪火腿的研究結果也發現，火腿中含有大量的低分子質量多肽，尤其是二肽。

本實驗以金華火腿中提取的粗肽液為研究對象，以常用的抗氧化劑BHT和GSH為對照，研究了金華火腿粗肽液對自由基的清除能力，螯合金屬離子能力，在模擬脂肪氧化體系中的抗氧化作用以及對蛋白質氧化的抑制作用，以此來衡量金華火腿粗肽液的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火腿 浙江省金字火腿食品有限公司。火腿按傳統加工工藝進行，傳統工藝包括攤晾、腌制、浸泡、洗刷、曬腿、成熟和后熟等過程。在樣品成熟后隨機抽取5塊，取股二頭肌作為分析樣品。樣品編號后，在分析測試前于-20℃冰柜中保存。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、丁基羥基甲苯（BHT）、谷胱甘肽（GSH）和2，2'-偶氮二異丁基脒（AAPH） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純 南京建成化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司；T25勻漿機 德國IKA公司；Avanti J-E高速冷凍離心機 美國Beekman Coulter公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；ES2030冷凍干燥機 日本Hitachi公司；Spectral Max M2e多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗肽液的提取

參照Escudero等[11]的方法進行。取成熟結束的成品股二頭肌25g攪碎放入三角瓶中，加入100mL 0.01mol/L HCl溶液，勻漿（22000r/min，4次，每次10s）。之后在4℃、12000×g條件下離心20min。吸取上清液，過濾后加入3倍體積的乙醇，4℃條件下保持20min后，再次在4℃、12000×g條件下離心20min，上清液在旋轉蒸發儀上濃縮，濃縮干燥后溶解于去離子水中，在分析測試前于-20℃冰柜中保存。

1.3.2 ·OH清除率測定[12]

羥自由基（·OH）清除率的測定采用鄰二氮菲法。反應以H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應產生羥自由基，總反應可用下式表示：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH。鄰二氮菲-Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其536nm最大吸收峰消失，根據上述原理，以A536nm變化反映羥自由基的氧化作用。

配制蛋白質質量濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL的粗肽液，并以相應質量濃度的GSH和BHT為對照組。樣品管：取0.6mL鄰二氮菲溶液（5mmol/L）加入0.4mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L、pH7.4）混勻后，加入0.6mL樣品溶液及0.6mL EDTA（15mmol/L），再次混勻，之后加入0.6mL FeSO4 溶液（5mmol/L），用去離子水補至體積2.8mL，充分混勻后加入0.8mL H2O2（0.1%），搖勻后于37℃保溫1h，測536nm波長處吸光度A536樣品；損傷管：以去離子水代替樣品，其余步驟同樣品管，所測吸光度計為A536損傷；未損傷管：以去離子水代替H2O2，其余步驟同損傷管，所測吸光度計為A536未損傷。·OH清除率計算如下：

·OH清除率/%=（A536樣品-A536損傷）/（A536未損傷-A536損傷）×100

1.3.3 DPPH自由基清除率測定

將肽液配成質量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的粗肽液，測定其清除DPPH自由基的能力，并以相應質量濃度的GSH和BHT為對照組。清除DPPH自由基參照Shimada等[13]的方法。將0.5mL DPPH自由基溶液（0.2mmol/L，溶于95%乙醇）置于試管中，加入0.5mL肽液，振蕩混勻，室溫放置30min后，在517nm波長處測樣品的吸光度，以0.5mL 95%乙醇加入0.5mL蒸餾水為空白，對照組為0.5mL DPPH自由基溶液加上0.5mL 95%乙醇在測定波長下的吸光度。粗肽液對DPPH自由基的清除能力計算如下：

DPPH自由基清除率/%=[1-（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）]×100

1.3.4 螯合金屬離子能力的測定

參考Dinis等[14]的方法并有所改進。用去離子水配制質量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的粗肽液，并以相應質量濃度的GSH和BHT為對照組。分別取1mL待測溶液加入0.05mL FeCl2（2mmol/L）中，混勻后加入0.2mL Ferrozine（5mmol/L）試劑啟動反應，將混合物劇烈搖動混勻后于室溫下靜置10min，于562nm波長處測定溶液的吸光度。對照管以去離子水代替樣品，待測物抑制Ferrozine-Fe2+復合物形成的百分率通過下式計算：

亞鐵離子螯合率/% = [（A對照-A樣品）/A對照]×100

1.3.5 多肽抑制亞油酸體系中脂質過氧化能力的評價方法

參考Qian等[15]的方法，用去離子水配制質量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的肽液，并以相應濃度的GSH和BHT為對照組。取2mL樣品，加入0.5mL無水乙醇溶液，2.5mL亞油酸乳化液（0.02mol/L，pH7.0），2mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH7.0）。亞油酸乳化液的配制：0.2804g亞油酸，0.02804g吐溫-20，用磷酸鹽緩沖液定容至50mL。將溶液密閉后放在暗處并保持10min。空白對照以去離子水和無水乙醇代替樣品、GSH和BHT。

過氧化值的測定采用硫氰酸鐵法：取0.1mL亞油酸混合溶液，依次加入4.7mL 75%乙醇溶液和0.1mL 30%硫氰酸銨，再加入0.1mL 0.02mol/L已溶于3.5%鹽酸中的FeCl2快速混勻，準確反應 3min后，在500nm波長處測吸光度。0時刻測定的OD值計為A0，以后每隔24h測定一次，OD值計為At，樣品的抗氧化能力以144h時氧化抑制率表示。抑制率按下式計算：

抑制率/%=[1-（A樣，144h-A樣，0h）] /（ A空，144h-A空，0h）×100

1.3.6 對蛋白質氧化影響的測定

蛋白質氧化的測定參考Kwon等[16]的方法，略作修改。用磷酸鹽緩沖液配置一定質量濃度的牛血清蛋白標準液，以20mg/mL的2，2'-偶氮二異丁基脒（AAPH）作為氧化劑氧化牛血清蛋白，構建蛋白質氧化體系，并以不同質量濃度的金華火腿粗肽液、BHT和GSH為抗氧化劑，以不加抗氧化劑組為陽性對照組，將每組分別混合后，在37℃孵育24h后，用0.02%的BHT加入混合液終止反應。樣品通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行驗證。

2 結果與分析

2.1 金華火腿粗肽液清除·OH的能力

羥自由基（·OH）是最活躍的一種活性分子，也是進攻性最強的化學物質之一，幾乎可以與所有的生物分子、有機物或無機物發生各種不同類型的化學反應，并伴有非常高的反應速率常數和負電荷的親電性，其半衰期約為10-9s。羥自由基是目前所知活性氧自由基中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，可以通過電子轉移、加成以及脫氫等方式與生物體內的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化損傷，使細胞壞死或突變，羥自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬等有關[17]。因此，清除·OH將對人體防御各種疾病有重要意義[18]。如圖1所示，隨著濃度的增加，金華火腿粗肽液、BHT和GSH清除·OH的能力都顯著增加（P<0.05）。但是金華火腿粗肽液抗氧化能力增加的速度小于BHT和GSH。當質量濃度達到1.5mg/mL時，金華火腿粗肽液的抗氧化能力顯著小于BHT和GSH，但在此質量濃度下，金華火腿肽液的抗氧化能力也接近90%，具有相當強的清除·OH的能力。

2.2 金華火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力

由圖2可以看出：金華火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力顯著高于GSH，但低于BHT（P<0.05）。當質量濃度為4mg/mL時，金華火腿粗肽液的抗氧化能力與BHT差異不顯著，當質量濃度達到5mg/mL時，金華火腿粗肽液、GSH和BHT清除能力差異不顯著，均達到95%左右。由于DPPH自由基為脂溶性抗氧化劑，因此BHT對其親和能力很強，由于GSH肽鏈較短，親脂性較差，因此GSH對DPPH自由基的清除能力較差。而金華火腿中所含肽大多為5～16個氨基酸組成，具有一定的疏水性，因此隨著濃度的增加，對DPPH自由基的親和能力逐漸增加。

2.3 金華火腿粗肽液螯合Fe2+的能力

從已有的研究的數據來看，體內鐵離子水平的增加會增加患各種慢性疾病的風險，如心血管疾病、癌癥以及一些神經性疾病[19-20]。鐵離子會導致體內活性氧的增加，而這些活性氧物質會導致DNA和脂質的破壞。此外，鐵離子是一些自由基產生的前體，這些自由基導致的DNA損傷更有利于癌癥和癌癥細胞的增殖。Babbs[21]和Nelson[22]提出腸道暴露在鐵離子中可能是一些發達國家以及肉類消費量高的地方人類患結腸癌的主要原因。關于活性氧和金屬離子誘導的信號通路如圖3所示。而短肽中暴露的中性和酸性氨基酸，其含有的游離氨基和羧基可以螯合金屬離子，以抑制由金屬離子產生的自由基。從圖4可以看到：金華火腿粗肽液螯合鐵離子的能力顯著大于BHT和GSH（P<0.05）。這有可能與金華火腿粗肽液中含有大量的中性和酸性氨基酸組成的肽段有關。

2.4 金華火腿粗肽液抑制脂質過氧化的能力

由圖5可以看出：金華火腿粗肽液、GSH和BHT抑制脂質過氧化的能力隨質量濃度增加呈上升趨勢。當質量濃度小于4mg/mL時，金華火腿粗肽液抑制脂質過氧化的能力顯著小于GSH和BHT，但當質量濃度達到4mg/mL時，三者之間差異不顯著。金華火腿粗肽液抑制脂質過氧化的能力在質量濃度為5mg/mL時，達到46.7%。前人研究表明，含有 5～16個氨基酸的肽段能更好地抑制亞油酸的過氧化[23]。表明金華火腿中粗肽液中可能含有較多含有5～16個氨基酸的肽段，因而能很好很好地螯合脂質過氧化產生的自由基，而GSH肽鏈較短，親水性增強，因而不能螯合脂質過氧化產生的自由基[24]。

2.5 金華火腿粗肽液對蛋白質氧化的影響

研究表明：體內大分子物質氧化產物的聚集是引起體內很多變化的主要原因。細胞蛋白質的氧化會產生很多疾病。一些蛋白質的氨基酸殘基穩定性很差，極容易受到活性氧類物質的攻擊而發生不同程度的氧化。AAPH是一種水溶性的氧化引發劑，在人體適宜溫度條件下，它會分解產生烷基自由基，而后很快與氧氣反應生成烷基過氧化自由基[25]，進而進攻蛋白質和DNA。各種抗氧化物質對由AAPH引起的牛血清蛋白氧化的抑制情況如圖6所示。金華火腿粗肽液對于蛋白質氧化有一定的抑制作用，并且隨著質量濃度的增加，抑制作用隨之增強。當質量濃度達到5mg/mL時，可以大幅抑制牛血清蛋白的氧化。而GSH和BHT基本可以完全抑制蛋白質氧化。

3 結 論

金華火腿粗肽液的抗氧化活性隨著質量濃度的增加而增加，清除自由基能力與GSH和BHT相當，螯合Fe2+能力顯著高于BHT和GSH，并具有一定程度抑制脂質過氧化和蛋白質氧化的能力。金華火腿生產過程中產生大量肽段，這些肽段強大的抗氧化能力能夠在一定程度上抵消火腿本身食鹽含量高的不利影響。

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