紫花苜蓿的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究

李云玲　苗錦山

摘 要：以紫花苜蓿為材料，研究了不同外植體和不同激素處理對(duì)苜蓿愈傷和胚狀體分化的影響。結(jié)果表明，子葉和下胚軸作外植體，在MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L +BA 0.5mg/L培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率較高，下胚軸的誘導(dǎo)率要高于子葉；下胚軸在MS+BA 3.0mg/L培養(yǎng)基中胚狀體分化率最高。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；組織培養(yǎng)；快繁技術(shù)

中圖分類號(hào) Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）07-51-02

目前，土壤鹽漬化是影響生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重問題。在鹽脅迫下，植物代謝會(huì)受抑制，生長變得緩慢，嚴(yán)重時(shí)，葉子萎蔫，甚至死亡。目前，全世界的鹽漬化土地約占陸地面積約30%，而在中國，鹽漬地的比例明顯高于世界平均水平，天津東部濱海平原區(qū)土壤鹽漬化尤其嚴(yán)重。另外，日光溫室的大面積普及使土壤鹽漬化的問題也越來越明顯[1]。

紫花苜蓿，豆科苜蓿屬，是一種比較抗鹽的作物[2]，其分布遍及五大洲，苜蓿中蛋白質(zhì)含量可達(dá)80%，營養(yǎng)價(jià)值豐富，而且再生性強(qiáng)，是改良土壤的良好綠肥[2-3]，因而被稱為“牧草之王”。如果能在鹽堿地上種植苜蓿，既可以起到綠化作用，又可創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還可以改良土壤，兼顧社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益[4]。由于苜蓿是多年生異花授粉植物，自交結(jié)實(shí)率低，僅通過常規(guī)育種進(jìn)行品種改良非常困難，而以植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良苜蓿品質(zhì)是一條有效途徑[5]。筆者通過研究不同外植體及不同培養(yǎng)基激素改變對(duì)愈傷組織形成和芽分化的影響，以期建立紫花苜蓿的快繁再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試苜蓿品種為紫花苜蓿，由濰坊科技學(xué)院蔬菜工程技術(shù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 將紫花苜蓿的種子流水充分洗凈后，浸泡10h左右，然后放入超凈工作臺(tái)中。先用75%的酒精浸泡30s，然后用無菌水沖洗3次，取出后用0.1%的升汞消毒10min，再用無菌水沖洗3～5次，洗去多余的升汞。接種到MS培養(yǎng)基中，7～10d后種子陸續(xù)萌發(fā)、子葉展開。

1.2.2 不同激素對(duì)不同外植體愈傷誘導(dǎo)的比較試驗(yàn) 以無菌苗的子葉、下胚軸和葉片為外植體，在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別附加不同濃度的生長素2，4-D、NAA和細(xì)胞分裂素6-BA、3%蔗糖、10mg/L的硝酸銀、0.2%的木炭粉。每種培養(yǎng)基處理6瓶，每瓶接種10個(gè)外植體。培養(yǎng)20d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 將生長較好的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)15d后進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 不同激素對(duì)愈傷組織分化的比較試驗(yàn) 將愈傷組織階段生長了15d左右的愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別附加不同濃度的生長素NAA、細(xì)胞分裂素6-BA、KT、3%蔗糖和0.2%的木炭粉。每種培養(yǎng)基處理6瓶，每瓶接種5塊愈傷組織，培養(yǎng)25d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)誘導(dǎo)紫花苜蓿愈傷組織的影響 由表1可知，在M1～M4 4種培養(yǎng)基中，下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率均在90%以上，子葉的誘導(dǎo)率也較高，在75%以上，兩者在M1培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)率均可達(dá)到100%，而在M5中，兩者誘導(dǎo)率都比較低。葉片在5種培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)率都很低。

從形成的愈傷組織形態(tài)來看，下胚軸和子葉形成的愈傷組織質(zhì)地密實(shí)，顏色為綠色，表面有細(xì)小突起，后期分化能力較強(qiáng)；而葉片形成的愈傷組織，顏色為黃白色，水浸樣，松軟粘連，難以繼代，后期分化能力很差。將子葉和下胚軸生成的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為M1，15d后觀察，愈傷組織體積增大，利于進(jìn)行分化培養(yǎng)。

2.2 不同激素處理對(duì)苜蓿愈傷組織形成的影響 由表1可知，無論是子葉還是下胚軸，隨生長素2，4-D和NAA濃度的增加，愈傷形成率也越來越高。這表明生長素對(duì)于愈傷的形成作用明顯，是愈傷組織形成的主要因素。細(xì)胞分裂素6-BA的濃度也影響愈傷組織的誘導(dǎo)率，隨6-BA濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率也會(huì)越高。2，4-D，NAA和6-BA在本次試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，愈傷組織誘導(dǎo)率均隨彼此濃度的增加而增加。

2.3 不同激素對(duì)苜蓿胚狀體分化的影響 將誘導(dǎo)出的下胚軸愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，15d后轉(zhuǎn)移到表2中所列4種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表2。可以看出，細(xì)胞分裂素對(duì)苜蓿分化率有著較重要的作用。隨6-BA濃度的增加，胚狀體的分化率也越高；可選用添加了BA2.0～3.0mg/L的MS培養(yǎng)基進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)。在培養(yǎng)基中同時(shí)加入生長素時(shí)，分化率反而下降。分化成功的胚狀體經(jīng)過約25d后，可以在培養(yǎng)基上生成小苗。

3 討論與小結(jié)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織及胚狀體分化的培養(yǎng)基中加入硝酸銀及木炭粉，接種的外植體褐變程度會(huì)減輕，并且有助于形成的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，顏色發(fā)綠，有突起，容易形成胚狀體。這一結(jié)果與朱海軍等[6]、杜何為等[7]的研究是一致的。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同類型的外植體會(huì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響。子葉和下胚軸均可作為外植體再生，但是下胚軸相比子葉而言，其具有更短的愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間、更高的誘導(dǎo)率和胚狀體分化率，這與其他研究者得到的結(jié)論相一致[8-9]，因此在下一步實(shí)驗(yàn)中可以把下胚軸作為紫花苜蓿組織培養(yǎng)首選的外植體。

參考文獻(xiàn)

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[5]馬海燕，張博，郝興明，等. 苜蓿高效再生體系研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué)，2005，22（11）：30-33.

[6]朱海軍，俞紅強(qiáng)，義鳴放. 藍(lán)刺頭組織培養(yǎng)和葉片再生植株的研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，21（6）：581-584.

[7]杜何為，許先鳳，黃敏，等. 硝酸銀對(duì)玉米幼胚組織培養(yǎng)的影響[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（8）：62-63.

[8]危曉薇，蔡麗娟，李仁敬.紫花苜蓿組織培養(yǎng)及其再生植株[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（2）：73-75.

[9]舒文華，耿華珠，閻倫興.紫花苜蓿胚軸愈傷組織培養(yǎng)與植株再生[J].草業(yè)科學(xué)，1993，10（3）：65-67.

（責(zé)編：徐世紅）