熒光原位雜交在環境微生物學中的應用及進展

慕慶峰

摘 要：隨著科技的不斷發展，在環境微生物學中熒光原位雜交技術被越來越廣泛的應用。FISH技術是利用有熒光標記的特異性寡核苷酸探針和細胞中相應的DNA相結合的方法，來達到檢測和鑒定微生物的目的。這項技術是當前環境科學界研究的熱點，本文就對熒光原位雜交技術在環境微生物學中的應用和進展進行研究。

關鍵詞：熒光原位雜交技術； 環境微生物學； 應用和進展

中圖分類號：Q93-33 文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2013）07-135-001

近些年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，使得微生物學領域的研究發生了很大的變革，借助分子生物學方法來進行微生物的鑒定和檢測成為了現代微生物診斷以及生態學研究的重要手段。FISH技術是一種將分子生物學精確性、顯微鏡可視性的特點進行結合的技術，它也可以對微生物群落來進行評價。現在FISH技術已經被很廣泛的應用于環境微生物學中了，主要用于揭示微生物原位生理學功能和特性。

一、熒光原位雜交技術概述

（一）原理

熒光原位雜交技術是將核糖體內中高度保守、長度適中的16SrRNA序列來作為理想的基因分類靶序列，然后根據這個序列的特異性、保守性來設計所需的不同級別和分類的寡核苷酸探針，并且對特意核苷酸序列中帶標記的RNA或者DNA分子進行識別，這個探針和待檢測的靶DNA是同源互補的，經過變性、退火、復性的過程來形成核酸探針和靶DNA的雜交體。這種技術所使用的寡核苷酸探針是經過了熒光標記的約為20bp的特異性核苷酸片段，并利用這報告分子和熒光素標記具有的特意親和素間的免疫化學反應，通過熒光檢測系統來對要被檢測的DNA進行定位、定性和定量的分析。

（二）特點

作為一種非放射性的檢測系統，FISH技術有其特有的屬性和優點：

1.FISH是一種非放射性的檢測系統，采用的是生物素標記探針，避免了輻射性污染；

2.熒光探針具有穩定性和經濟性，每進行一次標記就可以在兩年之內進行使用，并且在一般的具有熒光顯微鏡的實驗室都可以進行使用；

3.FISH技術基于抗原鑒特異性識別和結合的特點，具有特異性好、定位準確、實驗周期短以及靈敏度強等優點，并且進行長度為1kbDNA序列的定位時，其靈敏度是和放射性探針不相上下的；

4.多色的FISH可以同時進行多種DNA序列的檢測，可以應用的范圍是十分廣泛的。

（三）步驟

熒光原位雜交技術的操作步驟主要有七項，即1.樣品固定；2.樣品預處理；3.樣品預雜交；4.樣品和探針變性；5.雜交；6.漂洗去除沒有結合的探針；7.對雜交信號進行檢測。

二、熒光原位雜交在環境微生物學中的應用

（一）對環境微生物多樣性的診斷

FISH對于環境微生物多樣性的診斷是其在環境微生物學中比較具有代表性的應用。環境微生物研究方式主要是純培養，但是環境微生物種類眾多，只有很小的一部分能夠被培養，所以這種方式會使其多樣性分析產生的結果具有局限性，有研究人員發現在不同的環境微生物研究中99%以上的微生物種類是不能夠被培養的。熒光原位雜交技術能夠將微生物環境中的完整細胞景象信息進行再現還愿，精確度較高，因此在現在的微生物多樣性的研究領域中被廣泛的應用。FISH技術在近幾年中，對于自然環境微生物群落的研究成果比較明顯，有對海水沉積物群落的研究結果，也有海水、河水、高山湖雪水中的浮游菌體、根系表面以及土壤之中的寄居群落。熒光原位雜交技術不僅可以提供微生物在某一時刻的景象信息，還能夠檢測生物環境中微生物群落以及其種群動態。與此同時，FISH技術還被應用于鑒定和檢測沒有培養出來的種屬和新種屬，例如酸桿菌屬、巨大硫酸鹽細菌、全噬菌屬等。這項技術已經成為探究自然菌群生態學組成和群落對于自然、人為因素的動態變化的答應研究最有利的一種科技手段了。

（二）對硝化細菌的研究

氨氧化菌和硝化菌的數量以及其空間分布式和微生物在硝化、反硝化的過程中所處階段是相關聯的，由此可見，對于生物處理系統中的硝化菌、氨氧化菌進行的研究是調控廢水脫氮工藝想要正常運行的重要參數。傳統的研究方式步驟過多，有分離、富集、分類、鑒定等，會耗費很多時間，這主要是因為硝化細菌在生理上是一種十分特殊的化能自氧菌。FISH技術能夠解決這類問題，在很早之前就有研究者將這一技術引入到了硝化細菌檢測中，建立起了一套比較完善的硝化細菌的FISH檢測法。隨著時代發展和科技的進步，人工設計合成的硝化細菌、氨氧化菌探針不斷地被研究出來，FISH技術被越來越廣泛地應用到了活性污泥系統以及消化流化床反應器、膜生物反應器等的污水處理系統中去了。

綜上所述，熒光原位雜交在環境微生物學中的應用是十分廣泛的，這項技術對于微生物種類多樣性的研究以及處理三廢都有很重要的意義。但是，FISH技術在應用中仍存在一些問題，隨著研究的不斷深入和不斷完善，這些問題必將被解決，熒光原位雜交技術對于環境微生物學一定會有更加重大的理論和現實意義。

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