感冒疏風顆粒的微生物限度檢查方法學驗證

方慧祥　解翠珠

摘要：目的：建立感冒疏風顆粒微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2010版的要求[1]，通過接種代表性的陽性菌株，用常規法、稀釋法及薄膜過濾法對五株陽性菌株進行回收率測定。結果：該樣品沒有抑菌性，常規法、稀釋法及薄膜過濾法對五株陽性菌株回收率均高于70%。結論：本樣品細菌數、霉菌數和酵母菌數及控制菌大腸埃希菌均可采用常規法進行檢查。

關鍵詞：感冒疏風顆粒；微生物限度檢查；回收率；方法學驗證

中圖分類號：R284.2文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2013）08-0059-02

感冒疏風顆粒具有辛溫解表，宣肺和中的功能[2]。臨床用于治療風寒感冒，發熱咳嗽，頭痛怕冷，鼻流清涕，骨節酸痛，四肢疲倦。當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌數計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定[1]。本文通過接種代表性的五株陽性菌株，采用常規法、稀釋法及薄膜過濾法進行微生物限度檢查方法學驗證實驗，為該樣品建立了微生物限度檢查方法。

1儀器與材料

1.1儀器HTY-2000A集菌儀（杭州高得醫療器械有限公司）；開放式集菌器（北京牛牛基因技術有限公司，批號：20101005）。

1.2樣品感冒疏風顆粒（云南雄業制藥有限公司，規格/袋，批號20110101，20110102，20110103，20101001，20101105）。

1.3培養基和試劑改良馬丁液體培養基（批號，1011042），改良馬丁瓊脂培養基（批號，010315），玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號，110208），營養肉湯培養基（批號，110120），營養瓊脂培養基（批號，101224），膽鹽乳糖增培養基（批號，101226），北京三藥科技開發公司。

1.4菌種大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]（中國藥品生物制品檢定所提供）

2方法

按中國藥典2010版一部微生物限度檢查法（附錄XⅢ C）[1]進行實驗。

2.1菌液制備取經34℃培養18～24 h，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌肉湯液體培養物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7備用；取經24℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-6備用；取經培養一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9%氯化鈉溶液3mL，洗下孢子，轉移至另一空管，標準比濁后，取1 mL加入0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至10-4備用。

2.2菌液的檢驗取上述金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌10-5～10-7稀釋液各1 mL，用45℃營養瓊脂培養基20 mL注皿，各平行測定兩皿，30～35℃培養48 h，計數，應約為50～100 cfu/mL；取上述白色念珠菌10-5～10-6稀釋液及上述黑曲霉菌10-4孢子懸液各1 mL，用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20 mL注皿，各平行測定兩皿，23～28℃培養，逐日觀察計數，應約為50～100 cfu/mL。結果見表1。

2.3供試液制備取樣品10 mg，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，用勻漿議混勻，作為1：10的供試液。

2.4回收率的測定

2.4.1細菌數霉菌數常規法測定試驗組：取1：10供試液1 mL、50～100 cfu 試驗菌同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h逐日觀察結果。

菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數（同菌液檢驗）。

供試品對照組：取1：10供試液1 mL加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h逐日觀察結果，測定供試品本底菌數

2.4.2細菌數霉菌數稀釋法測定試驗組：取1：10供試液0.2 mL/皿、50～100 cfu試驗菌同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h逐日觀察結果。

菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數（同菌液檢驗）。

2.4.3細菌數霉菌數薄膜過濾法測定取1：10的供試液1 mL，注入開放式濾器（先用少量緩沖液潤濕濾器），用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100 mL共4次（每次充分振搖濾器，總沖洗400 mL），留有少量緩沖液加1 mL（50～100 cfu）試驗菌混勻，抽干后，取出濾膜菌面朝上貼入規定瓊脂平板培養基中，置規定溫度培養48 h，結果見表2。

2.5回收率的計算按如下公式計算試驗組的加菌回收率：

試驗組的加菌回收率=

試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數菌液組的平均菌落數×100%

2.6控制菌檢查方法的驗證

2.6.1常規法取1：10供試液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，同時加入上述大腸埃希菌液1 mL，置35℃培養24 h；取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養基，同時加入金黃色葡萄球菌液1 mL，置35℃培養24 h，作為陰性菌對照組。另取1：10供試液1 mL加入10 mL膽鹽乳糖發酵培養基中，同時加入上述大腸埃希菌液1 mL，置35℃培養24 h；取1：10供試液1 mL加入10 mL膽鹽乳糖發酵培養基中置35℃培養24 h，作為陰性對照。

3結果與討論

3.1結果見表1、表2。

4結論

本樣品通過接種5株陽性試驗菌株進行方法學驗證，通過進行3次平行實驗，驗證了其方法的有效性和可靠性，建立了感冒疏風顆粒微生物限度檢查的方法：細菌數、霉菌數和酵母菌數、控制菌大腸埃希菌均可采用常規法法進行檢查。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部.北京：化學工業出版社，2010.

[2]國家中成藥匯編.中成藥地方標準上升國家標準部分[S].北京：人民衛生出版社，2001.

（收稿日期：2013-06-17）