淺析基因定點誘變在蛋白質(zhì)工程中的應用

胡文斌　朱云波

在蛋白質(zhì)工程中對蛋白質(zhì)結(jié)構進行的設計改造，最終還必須通過基因來完成。設計改造后的蛋白質(zhì)在自然界生物中不存在相應的基因，往往需要通過人工化學合成或基因修飾獲得，其中基因修飾的主要方法就是基因定點誘變。如在高中生物人教版選修3教科書“蛋白質(zhì)工程的崛起”這一節(jié)中談到：“將天冬氨酸激酶的第352位的蘇氨酸變成異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺變成異亮氨酸，就可以使玉米葉片和種子中的游離賴氨酸分別提高5倍和2倍。”這個實例中，改造后的蛋白質(zhì)基因與原始基因只有一個堿基對的差異，其所用的方法就是基因定點誘變。但是，基因突變往往是不定向的，是隨機的，研究者如何讓基因按照人的意愿進行定向突變呢？為什么沒有用化學合成法合成基因呢？化學合成法有什么弊端嗎？下面就這些問題作簡要分析和闡述。

1 基因定點誘變的原理和方法

基因定點誘變技術是蛋白質(zhì)工程研究中的一種重要方法，其實質(zhì)是利用化學合成寡核苷酸和基因重組技術相結(jié)合的方法，按照預定設計，對已知基因的特定堿基進行定點增刪或轉(zhuǎn)換，最終改變對應的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構。最具代表性的定點誘變方法有以下三種。

1.1 寡核苷酸介導的定點誘變

利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突變，而不受限制酶切點的限制（圖1）。如果希望改變某個DNA的某個特定堿基，可以先合成一條突變堿基位于中間的寡核苷酸，一般長度約15～20 bp。這條寡核苷酸鏈除了突變堿基外，其余的序列與野生型DNA分子中的相應序列完全一致。然后將合成的寡核苷酸與由單鏈噬菌體做載體所攜帶的DNA克隆互補鏈混合，進行分子雜交。這段配對的寡核苷酸可以做為引物，在DNA聚合酶作用下合成完整的互補鏈，再用DNA連接酶連接起來。將此雙鏈DNA導入大腸桿菌中，經(jīng)擴增就可以得到大量可穩(wěn)定遺傳的的突變DNA克隆。

1.2 盒式定點誘變

盒式定點誘變是利用一段人工合成的含有突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相應序列。其中，合成的DNA片段稱為“盒”。通常的做法是：先制備好含有正常目的基因的重組質(zhì)粒，然后在目的基因需要突變的部位附近找兩個限制酶位點，利用合適的限制酶將二者之間的DNA序列切掉，而由一段人工合成含有突變堿基的雙鏈DNA片段通過DNA連接酶連接取代，從而達到基因定點突變的目的。此法的缺點在于突變區(qū)段的兩側(cè)需存在一對限制酶位點，限制了該方法的廣泛應用。

1.3 PCR介導的定點誘變

任何基因，只要知道兩端及需要變異部位的序列，就可用PCR誘變?nèi)ジ脑煸摶蛐蛄小Ｓ捎诜椒ê啽阋仔校Y(jié)果準確高效，因此PCR介導的定點誘變已成為最常用的方法。

PCR定點誘變有兩種情況。① 變異部位位于基因的末端。這種情況只需在人工合成5'端或3'端引物時引入變異堿基，便可使PCR產(chǎn)物（目的基因）的末端引入變異。② 變異部位位于基因的中間。這種情況需要借助重組PCR方法，可在DNA任意部位產(chǎn)生定點誘變（圖2）。首先在需要誘變的位置合成含有變異堿基的互補引物（引物b和c），然后分別與3'引物（引物a）和5'引物（引物d）進行PCR，這樣便可得到兩個PCR產(chǎn)物分別含有變異堿基，由于二者中間有一段序列彼此互補重疊，在重疊部位經(jīng)重組PCR就能得到基因的中間含變異堿基PCR產(chǎn)物。重組PCR不僅可在基因任意位點引入變異，還可在不同基因片段之間發(fā)生重組連接。

2 化學合成法的局限性

DNA的化學法合成不需要模板，在蛋白質(zhì)改造中可以依據(jù)研究人員設計的核苷酸序列直接合成基因。那么為什么不都用化學方法直接合成突變基因呢？這是由于化學法合成DNA的缺陷造成的。首先，化學合成的是單鏈，這個問題可通過合成互補鏈退火來部分解決。其次，在化學合成中不能保證前一步產(chǎn)物能100%延長到下一步的產(chǎn)物，隨著長度的延長，產(chǎn)物合成率下降，而且這些非全長的序列需除去以免影響后續(xù)應用。最后，在寡核苷酸的合成中也會出現(xiàn)大量的錯誤，而且出錯誤率隨長度增加而增加。對于較長的基因往往需要分成若干小的片段進行合成，然后經(jīng)拼接才能得到完整的基因，這使得基因制備難度加大，并且費用相對比較昂貴，從而導致化學合成法的應用具有一定的局限性。

從上述可以看到，定點突變技術在蛋白質(zhì)工程中具有重要應用價值。自1982年Zoller和Smith發(fā)表寡核苷酸介導的定點突變方法以來，通過不斷發(fā)展和創(chuàng)新，定點突變技術已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構和功能之間的復雜關系的有力工具，也是實驗室中改造、優(yōu)化基因常用的手段，其應用領域非常廣泛，在研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié)構、改造酶的活性或者動力學特性，提高蛋白的抗原性或穩(wěn)定性，改造啟動子或DNA作用元件，以及藥物研發(fā)、基因治療等方面都有非常重要的應用。

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