哮喘患兒單個核細胞FOXP3 mRNA表達應用實時熒光定量RT—PCR檢測的臨床意義

范光明

[摘要] 目的 探討哮喘患兒單個核細胞FOXP3 mRNA表達應用實時熒光定量RT-PCR檢測的臨床意義。 方法 選取來本院就診的29例哮喘患兒和24例正常健康兒童作為對照，對兩組病例應用流式細胞儀檢測外周血單個核細胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，并鑒定PCR產物特異性。 結果 哮喘患兒組CD4+CD25+Treg檢測結果為（8.26±2.04）%，顯著低于對照組（12.71±2.53）%，差異有統計學意義（P<0.01）。哮喘患兒組FOXP3/β-actin的2-△Ct值為（0.49±0.15），對照組為（0.62±0.18），兩者比較，有顯著性差異（P<0.05）。外周血單個核細胞中FOXP3 mRNA表達與淋巴細胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相關（r=0.679，P<0.05）。經融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均僅有單一擴增產物。 結論 對于哮喘患兒單個核細胞FOXP3 mRNA表達水平應用實時熒光定量RT-PCR檢測，方法簡便，結果穩定、可靠。

[關鍵詞] 哮喘；單個核細胞；FOXP3 mRNA；CD4+CD25+Treg；實時熒光定量RT-PCR

[中圖分類號] R446.43 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）08-125-02

CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）是一群具有免疫抑制功能的T細胞，在CD4+CD25+Treg上可見FOXP3特異性高水平表達，它具有反映CD4+CD25+Treg的活性水平[1-3]。研究表明，CD4+CD25+Treg與哮喘的發生和發展有著密切關系，CD4+CD25+Treg能夠對Th2細胞的活化起到抑制作用[4]。本研究探討了哮喘患兒單個核細胞FOXP3 mRNA表達應用實時熒光定量RT-PCR檢測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院就診的29例經哮喘診斷標準[5]確診的哮喘患兒，其中男19例，女10例；年齡3～14歲，平均（6±2）歲；哮喘病程2～8年。并選取24例正常無過敏性疾病史的健康兒童作為對照組，其中男15例，女9例；年齡3～13歲，平均（6.0±1.5）歲。兩組性別、年齡等一般資料經比較無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

采集靜脈血4 mL，分別裝入兩支EDTA抗凝試管中，各2 mL。應用流式細胞儀檢測外周血單個核細胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，采用融解曲線和瓊脂糖電泳鑒定PCR產物特異性，包括引物設計、淋巴細胞分離、逆轉錄、熒光定量PCR反應體系、擴增產物電泳分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS15.0統計學軟件，計量資料采用（）表示，采用t檢驗，計數資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 熒光定量方法學評價

2.1.1 特異性 FOXP3和β-actin擴增產物經電泳后出現約176bp和205bp兩條特異性條帶，經融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均只有一個尖峰，分別是82.4℃解鏈溫度和87.8℃解鏈溫度，說明FOXP3和β-actin分別僅有一擴增產物。

2.1.2 稀釋逆轉錄產物 10倍稀釋逆轉錄產物cDNA，0.637/反應為最低檢測限，0.637～0.796/反應為線性范圍，相當于Ct值18-37跨度，r=0.98。

2.1.3 精密度 重復測定Ct值為21和Ct值為35的2份標本，結果經對數處理后其批內CV值為1.6%～2.8%，批間CV值為2.5%～6.7%。見圖1。

圖1 精密度測定

2.2 兩組CD4+CD25+Treg結果比較

哮喘患兒組CD4+CD25+Treg檢測結果為（8.26±2.04）%，對照組為（12.71±2.53）%，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 兩組FOXP3/β-actin的2-△Ct值比較

哮喘患兒組FOXP3/β-actin的2-△Ct值為0.49±0.15，對照組為0.62±0.18，兩者比較，有顯著性差異（P<0.05）。

2.4 FOXP3 mRNA與CD4+CD25+Treg的相關性

外周血單個核細胞中FOXP3 mRNA表達與淋巴細胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相關（r=0.679，P<0.05）。

3 討論

與普通PCR比較，SYBR Green I實時定量PCR具有特異、快速、敏感特點。SYBR Green I實時定量PCR無需合成特異探針，故而使用方便，但非特異產物可干擾靶基因的產物定量。作為一種熒光染料，SYBR Green I能與雙鏈DNA非特異性結合并發出熒光，其與游離狀態熒光強度相比強百余倍，因此可以通過檢測熒光強度來檢測出雙鏈DNA數量。但檢測熒光強度也會出現假陽性結果，這是因為非特異性擴增或引物二聚體也可以產生熒光，從而干擾檢測結果。鑒于假陽性結果的出現，本研究為了區別是由PCR產物產生的熒光信號還是本底造成的熒光信號，在定量反應結束后特別進行了融解曲線分析。由于在融解曲線上PCR產物是單一峰，Tm值也較非目的產物要高[9]，因此可以通過分析融解曲線來證實擴增產物的特異性。本研究結果顯示，特異性FOXP3和β-actin擴增產物經融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均只有一個尖峰，分別是82.4℃解鏈溫度和87.8℃解鏈溫度，說明其擴增的特異性。

研究報道，兒童支氣管哮喘發病機制中免疫功能紊亂起著不容忽視的作用，目前關注的焦點在于淋巴細胞亞群的比例和功能紊亂。哮喘發病與免疫耐受的破壞和Th1/Th2功能失調有關。研究認為，CD4+CD25+Treg水平和功能的正常維持對良好的免疫耐受狀態建立有很好的作用，從而對哮喘的發生和發展起到阻止作用[6]。FOXP3作為一種特殊的轉錄因子，在CD4+CD25+Treg上特異性高水平表達，它可以反映CD4+CD25+Treg的活性水平[7-8]。本研究結果顯示，在外周血CD4+CD25+Treg的比例及FOXP3 mRNA的表達上哮喘患兒組較對照組低，表明因CD4+CD25+Treg數量不足，以致免疫抑制功能降低，效應性CD4+T細胞活化，特別是Th2細胞，大量致炎因子產生，從而使哮喘發作或持續。因此我們猜測，CD4+CD25+Treg與哮喘的發生和發展關系密切，對CD4+CD25+Treg的檢測將有助于哮喘患兒的診斷和治療。本研究結果還顯示，外周血CD4+CD25+Treg細胞數量和FOXP3 mRNA表達有相同的趨勢，存在一定的相關性。因此，這種從外周血單個核細胞中檢測FOXP3 mRNA的方法簡單，重復性好，敏感性和特異性較高，值得推廣。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-01-08）