寡核苷酸類藥物磷的定性定量分析

李保山??仲婕??朱德領??施明珠

[摘要]目的 用鉬酸銨比色紫外分光光度法測定抗肝癌藥物磷含量。 方法 用硝酸-高氯酸消解，鉬酸銨比色紫外分光光度法測定藥品中磷含量。用核磁共振31P-NMR譜，又進一步確定了本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學位移為55 ppm的PS鍵。 結果 分光光度法磷含量測定標準曲線為Y=0.13X+0.0227，r=0.9995，方法的精密度分別為：0.74%，重現性5.6%，回收率99.65%。 結論 鉬酸銨比色紫外分光光度法測定寡核苷酸類抗肝癌藥物和抗病毒藥物中磷的含量，可操作性強，回收率較高，可為其他核酸類藥物測定提供借鑒。31P-NMR譜進一步分析了P在硫代寡核苷酸藥物中磷的存在形式。

[關鍵詞]鉬酸銨紫外分光光度法；寡核苷酸；磷

[中圖分類號] O657.63 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）08-63-03

FLU和CT102為正在研制的硫代寡核苷酸類抗病毒藥物、抗癌藥物，均為含磷化合物，磷以磷氧鍵（PS）的形式存在。總磷量是一個固定的值，反映了寡核苷酸的純度，從寡核苷酸中測得了總磷量，就可知樣品中寡核苷酸的量，這就是用磷測核酸純度的理論依據，所以磷含量是本品原料藥的一個重要的質量控制指標，有必要準確定量，精確控制質量。

將有機磷酸化合物分解轉化成無機磷酸鹽的形式的方法一般有氧化分解法、磷鉬藍光度測定法[1-2]。氧化分解法操作雖簡便但由于磷在高溫灼燒之后對鉑絲有腐蝕作用，使得鉑絲逐漸破損變脆會影響結果的測定，現已少用[3]。我們應用現已有的儀器條件，將樣品先消解，制成水溶液，用紫外分光光度法測定了本品中總磷的含量[4]。用核磁共振31P-NMR譜，又進一步確定了本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學位移為55ppm的PS鍵。

1 儀器與試藥

紫外可見分光光度計，UV-2450，日本島津公司。VARIAN INOVA 600 核磁共振儀，美國瓦里安公司。

磷酸根離子1000 mg/L，全國化工標準物質委員會標準物質研究開發中心，批號：GBW（E）080525，磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉均為（優級純，國藥集團化學試劑有限分司生產）；濃硝酸，高氯酸，鉬酸銨，對苯二酚，亞硫酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產。

超純水：18.2 MΩ/cm，Millipore公司試驗用藥物：寡核苷酸抗流感新藥FLU，批號：20100512-1，20100706；寡核苷酸抗肝癌新藥CT102；批號：20120626，20120817-2，軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所九室。

2 測試條件

2.1 總磷含量（比色UV-VIS法）

鉬酸銨溶液的制備：精密稱取2.5 g鉬酸銨，加30 mL水溶解，最后加37.5%的硫酸溶液20 mL，即得。

對苯二酚溶液的制備：精密稱取對苯二酚0.5 g，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，再加濃硫酸一滴，即得。如產生顏色變化，則重配。

亞硫酸鈉溶液的制備（20%）：精密稱取5.0 g亞硫酸鈉置25 mL容量瓶中溶解，即得（臨用前配制）。

顯色與測定：量取樣品溶液15 mL置25 mL容量瓶中，加2.5 mL鉬酸銨溶液，搖晃，放置30 s。再加對苯二酚溶液2.5 mL。再加2.5 mL 20%的亞硫酸鈉溶液。最后加水至刻度。放置30 min，在730 nm處測吸收值。

2.2 核磁共振31P-NMR譜

溶劑：D2O；溫度：環境溫度；程序：延遲 1.000 s，暫停 47.0 度，捕獲時間 0.266 s；掃描寬度：60060.1 Hz；掃描次數：30000 次。觀測： P31，242.7908595 MHz；減 弱 波：H1，599.7718912 MHz；電源：46 dB 在采集時打開；在延遲時關閉 WALTZ-16 modulated。自動進樣：15μg/mL。

3 結果與討論

3.1 對照品溶液的制備和線性

對照品溶液的配制：精密稱取0.1860 g磷酸二氫鉀，置1000 mL容量瓶中，加水至刻度。

標準磷溶液的制備：分別量取1、2.5、5、10、15 mL置25 mL容量瓶中，不足15 mL的加水補足。分別加2.5 mL鉬酸銨溶液，振搖，放置30 s。再分別加對苯二酚溶液2.5 mL，和20%的亞硫酸鈉溶2.5 mL液，加水至刻度，放置30 min。用水做隨行空白作為參比溶深夜，在730 nm處測其吸收值。以P濃度為橫坐標，吸收值為綜坐標，繪制標準曲線：Y=0.13X+0.0227，r=0.9995。

3.2 樣品前處理

取干燥至恒重的樣品43～44 mg，精密稱定（43.5 mg），加水溶解，置50 mL容量瓶中，加水至刻度。取此溶液10 mL于圓底燒瓶中，加水10 mL、玻璃珠數粒和濃硝酸2 mL，緩緩加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加濃硝酸5 mL，用調溫電熱套加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加5 mL高氯酸，用調溫電熱套加熱，待冒白煙后，于瓶口處放一漏斗，使其回流并回流濃縮直至溶液為3 mL，放置，待冷卻，定量轉移至100 mL容量瓶中，用水沖洗燒瓶數次，加水至刻度，即得樣品溶液。

3.3 精密度試驗

取磷酸二氫鉀標準溶液（4.241 mg/L），按2.1項下方法顯色后，重復測定5次，RSD為0.74%。

3.4 重現性試驗

取同一批樣品（CT102，批號20120626），5份，按3.2項下樣品處理方法制得樣品貯備液，按2.3項下顯色并測定，樣品中磷分別為8.345%、8.982%、8.273%、7.666%、8.415%，平均含量為8.34%，RSD=5.6% 。

3.5 回收率測定

取干燥至恒重的樣品（CT102，批號20120626）43.5 mg，用水溶解，置50 mL容量瓶中，加水至刻度。分別取5 mL，7份，分別置于圓底燒瓶中，其中6份分別加入磷酸二氫鉀標準溶液（C=0.186 mg/mL）2.0，2.0，2.5，2.5，3.0和3.0 mL，剩余一份不加標液。然后各加水至20 mL，玻璃珠數粒，濃硝酸2 mL，用調溫電熱套加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加濃硝酸5 mL，用調溫電熱套加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加5 mL高氯酸，用調溫電熱套加熱，待冒白煙后，于瓶口處放一漏斗，使其回流并回流濃縮直至溶液為3 mL，放置，待冷卻，定量轉移至100 mL容量瓶中，用水沖洗凈燒瓶數次，加水至刻度，即得回收率測定樣品溶液。從樣品溶液中各取10 mL置于25 mL容量瓶中，加2.5 mL鉬酸銨溶液，震蕩并放置30 s，再加2.5 mL對苯二酚溶液，最后加2.5 mL 20%的亞硫酸鈉溶液，空白為不加對照品母液其余相同的溶液，放置30 min。用紫外可見分光光度計于730 nm處測其吸收值，依標準曲線計算磷的量，測定回收率。回收率結果如表2。

3.6 核磁共振31P-NMR譜P S鍵

用核磁共振31P-NMR譜，確定本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學位移為55 ppm的PS鍵。

圖1 PS鍵核磁共振31P-NMR譜圖

4 結論

用硝酸-高氯酸消解，鉬酸銨比色紫外分光光度法測

定寡核苷酸類抗肝癌藥物和抗病毒藥物中磷的含量，簡單易行，操作性強，結果穩定性好，回收率較高，可為其他核酸類藥物測定提供借鑒。

本文鉬酸銨比色紫外分光光度法[4]測定該藥品中磷含量測定磷含量，兩批CT102中磷含量為8.345%（20120626）和8.22%（20120817-2）；兩批FLU中磷含量為8.89%（20100706）和8.982%（20100512-1）。

用核磁共振31P-NMR譜，確定了本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學位移為55 ppm的PS鍵。見圖1。

[參考文獻]

[1] 劉德富.卵磷脂中磷的分光光度法測定[J].松遼學刊（自然科學版），1998，10 （4）：41.

[2] 馬金玲，張紅軍.分光光度法測定大豆磷脂中磷的含量[J].黑龍江醫藥科學，2000，23（1）：21.

[3] 陳世彬，史亞軍，施俊輝，等.黃芩提取物亞微乳中磷含量的測定[J].成都中醫藥大學學報，2012，35（3）：70.

[4] 中華人民共和國國家標準.GB 11893-89水質總磷的測定鉬酸銨分光光度法[S].1989.

（收稿日期：2013-03-25）