cyclin D3調控LN308膠質瘤細胞遷移研究

章倩倩??周惠??屈良鵠??王麗京

[摘要] 目的 探討細胞周期蛋白D3（CCND3）在LN308膠質瘤細胞中的作用。 方法 根據NCBI GenBank中cyclin D3序列設計雙鏈siRNA，利用western blotting技術驗證設計的siRNA序列的有效性，并通過流式細胞術檢測抑制CCND3對LN308膠質瘤細胞周期進程的影響；通過transwell檢測CCND3對LN308細胞遷移的影響。 結果 經western blotting檢測，成功抑制了CCND3的表達。并且發現與對照組相比較，抑制CCND3表達對LN308細胞周期無影響，但是可以顯著抑制LN308細胞的遷移。 結論 LN308細胞中CCND3并不發揮調控細胞周期的功能，而是影響細胞的遷移，促進腫瘤的發展。本研究為臨床上靶向治療膠質瘤提供了理論基礎。

[關鍵詞] cyclin D3；膠質瘤；細胞遷移

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）08-31-03

神經膠質瘤是中樞神經系統中最常見的惡性腫瘤，發病率約占成人顱內腫瘤的40%～50%，并且其通過手術及放化療治療預后極差[1-2]。大量研究證實膠質瘤中存在cyclin D1和cyclin D3過表達，并且其表達程度與腫瘤惡性程度和患者預后相關[3-9]。然而，cyclin D3在膠質瘤中所發揮的作用報道較少。因此，確定cyclin D3對膠質瘤發生、發展的調控機制，有助于進一步研究以cyclin D3為靶點的藥物對膠質瘤進行治療。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人類神經膠質瘤細胞株LN308培養于含10%胎牛血清及添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基。并置于5% CO2培養箱中37℃培養至80%～90%融合后傳代培養，取處于指數生長期的細胞進行試驗。

1.2 試劑和儀器

DMEM高糖培養基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；cyclin D3 siRNA（上海吉瑪公司）；CCND3一抗（CST，美國）；Nocodazole（Sigma公司）；Transwell小室（Corning，美國）。CO2培養箱（Thermo，美國）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 方法

1.3.1 細胞分組及轉染處理 取指數生長期細胞于6孔細胞培養板每個孔接種3×105個細胞。分為正常生長組、空白對照組（NC）、siRNA組。24 h以后對細胞進行轉染，具體實驗方案參考LipofectaminTM 2000產品使用說明書。細胞接種24 h后吸取培養基，加入無血清無雙抗的DMEM培養基2 mL。準備轉染復合物，溶液A：250μL Opti-MEM培養基+5 μL LipofectaminTM2000，溶液B：250μL Opti-MEM培養基+50μM siRNA，室溫下分別靜置5 min。然后將溶液A與溶液B混合，室溫靜置20 min后加入細胞中。放入CO2培養箱靜置培養，6 h后換成含血清和雙抗的DMEM培養基。

1.3.2 蛋白免疫印跡 轉染siRNA后48 h的細胞用RIPA裂解蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每組取60μg總蛋白跑SDS-PAGE，250 v轉PVDF膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃一抗封閉過夜，然后將HRP標記二抗室溫孵育1 h，ECL法發光，暗室曝光、顯影、洗片。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期 在轉染siRNA后24 h的細胞中加入100 ng/mL Nocodazol將細胞周期同步化；繼續培養20 h，收集細胞培養液及細胞，離心收集細胞，加入冰冷的NP40/PI染液及25 mg/mL RNase A，37℃水浴30 min；通過300目篩網過濾入流式管中，上機檢測。

1.3.4 Transwell檢測細胞遷移 細胞轉染50 nM NC或者siRNA同時將transwell小室放入無血清，無雙抗的DMEM培養基中水化。轉染后細胞繼續培養24 h，收集細胞并計數，在transwell小室上室中加入4×104個細胞，繼續培養20 h，然后用1%結晶紫染色小室下方轉移過去的細胞，并擦除上室中未轉移的細胞，顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統計學處理

細胞周期分布用Modfit3.0軟件（Verity Software House，Topsham，ME，USA）分析。實驗采用3次獨立實驗結果數據進行統計，所得數據用統計軟件SPSS17.0進行分析，數據均以（）表示，在進行兩組之間的差異分析時選用雙尾Students t-test，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 驗證設計的siRNA序列的有效性

參照NCBI GenBank中人類CCND3 cDNA序列設計siRNA序列5'-GAUGCUGGCUUACUGGAUGdTdT-3'，對LN308細胞進行轉染，收取蛋白進行免疫印跡檢測。如圖1所示，設計的siRNA可以有效抑制CCND3的表達。

圖1 western blotting檢測siRNA抑制CCND3表達

2.2 CCND3對LN308細胞周期的影響

轉染后細胞加入100 ng/mL Nocodazole使細胞周期同步在G2期，檢測CCND3對LN308細胞周期的影響。如圖2所示，CCND3雖然為細胞周期蛋白，但是其在LN308細胞中對細胞周期并不發揮調控作用。

圖2 抑制cyclin D3表達對LN308細胞周期影響

2.3 CCND3對LN308細胞遷移的影響

LN308細胞中抑制CCND3表達后，通過Transwell實驗檢測LN308細胞遷移率的變化。如圖3A所示，發現CCND3下調后遷移至小室下方的LN308細胞數量顯著降低。并且通過統計發現，抑制CCND3的表達，LN308細胞遷移到下室的細胞數量減少了近60%（圖3B）。

圖3 抑制cyclin D3表達對LN308細胞遷移影響

A：Transwell檢測抑制CCND3表達對細胞遷移的影響（20×）；B：隨機取5個視野，對陰性對照組及CCND3 siRNA組細胞遷移的數目進行統計

3 討論

近年來的分子生物學研究表明，細胞周期蛋白D家族（cyclin D）包括cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3三種亞型，并且cyclin D家族成員在許多腫瘤中均表達上調[10]。雖然3種cyclin D家族成員在氨基酸序列上具有高度同源性，但是它們在組織和細胞中卻存在表達差異。在人腦膠質瘤組織中，cyclin D1在膠質瘤組織中的表達顯著高于正常腦組織，而cyclin D3僅在惡性程度較高的腫瘤組織中表達顯著上調[3-5]。表明cyclin D3與膠質瘤的發展具有相關性，但是其在膠質瘤中的作用到底如何有待進一步探討。

對于cyclin D1在腫瘤中的功能研究已有大量報道[11-13]，近年來對于cyclin D3失調在腫瘤發病過程中的作用越來越受到重視，成為腫瘤發病機理研究的熱點。本研究明確指出，cyclin D3作為細胞周期蛋白家族的一員，在LN308膠質瘤細胞中并不對細胞周期進程進行調控。對cyclin D3的研究發現，其與腫瘤的發生相關，而且與腫瘤的轉移、預后也密切相關[14-16]。高表達cyclin D3患者通常表現出臨床癥狀較重，發生轉移的概率更高，對傳統化療的敏感性差，生存率低。由于臨床相關性檢測發現cyclin D3僅在高度惡性的膠質瘤組織中高表達[3-5]，因此我們推測其可能調控膠質瘤細胞的侵襲。通過本研究結果分析，發現cyclin D3在惡性膠質瘤細胞中能夠調節細胞的遷移，說明cyclin D3雖然作為細胞周期蛋白家族成員，在膠質瘤中僅調控腫瘤細胞的遷移而促進腫瘤的發展。

膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，膠質瘤細胞生長速度較快，并且常沿著周圍組織和神經纖維浸潤性生長[1-2]。目前對于膠質瘤的治療方法為外科手術以及放、化療治療，但是難以將其徹底根除。因此，如何有效的治療膠質瘤及改善預后成為目前臨床關注的一個焦點。基因治療是目前治療腫瘤的最新治療方法，基于cyclin D3表達異常在膠質瘤的發展中扮演著重要角色，利用反義cyclin D3對靶細胞進行基因治療將為膠質瘤的治療提供新途徑。

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（收稿日期：2013-04-11）