鈣蛋白酶對動物肌肉嫩度的影響及營養調控

甘維熊　周輝霞

摘要：鈣蛋白酶是一種重要內源性蛋白酶，廣泛存在于肌細胞質中，它在Ca2+的激活下能降解肌原纖維蛋白，從而改善肉品嫩度。在介紹鈣蛋白酶結構的基礎上，闡述了鈣蛋白酶與宰后肌肉嫩度的關系、嫩化肌肉的機制及其營養調控。

關鍵詞：鈣蛋白酶；肌肉嫩度；營養調控

中圖分類號：S879.2；Q512 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）08-0072-02

動物肌肉嫩度是消費者區分肌肉品質的重要指標，Savell等[1]報道盡管牛腰大肌的風味和多汁性與其他部位的牛肉相比都較差，但是消費者卻認為牛腰大肌是最有價值的肌肉，因為該肌肉的嫩度最大。Shackelford等[2]報道美國居民為消費嫩度大的肌肉而愿意為此支付額外的費用。通過對宰前或宰后對動物施以營養或非營養手段的處理，以期肌肉的嫩度得以改善。動物宰殺后，肌肉要先后經歷老化階段和成熟階段，不同動物宰后肌肉老化的程度都相似，但是嫩化的程度和速率的變異非常大，因此它是影響肌肉成熟后嫩度差異的主要原因[3]。隨著對肉成熟嫩化的機理的深入研究發現鈣蛋白酶（Calpain）是肌纖維蛋白分解的重要內源性酶，鈣蛋白酶的活性與肌肉嫩度直接相關。

1 鈣蛋白酶結構

肌細胞中的鈣蛋白酶主要分布在Z線和肌漿膜附近的細胞質中，根據鈣蛋白酶表現半最高活性所需的Ca2+ 濃度的不同，可以將普遍存在的鈣蛋白酶分為兩種，一種為μ-Calpain激活所需Ca2+濃度為微摩爾級（1～65 μmol/L），另一種為m-Calpain激活所需Ca2+濃度為毫摩爾級（0.25～1.00 μmol/L）。它們都由2大小個亞基組成，其中28 ku小亞基在2種Calpain中是相同的，是單個基因的產物，而80 ku大亞基則是不同基因的產物，在氨基酸序列上有差異，表現在N末端序列長度和Ca2+結合區域的不同，但它們都含有保守的活性位點。μ-Calpain中的大亞基的質量稍大于m-Calpain中大亞基的質量（81 889 u VS 79 900 u）。μ-Calpain和m-Calpain大亞基都包含有4個結構域，從氨基端到羧基端分別編為結構域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。結構域Ⅰ在鈣蛋白酶活化后發生自溶而活化，而結構域Ⅱ含有催化活性中心，二者是蛋白酶的活性核心區。

2 宰后肌肉中Calpain活性變化

Veiseth等[4]研究發現，羊肌肉在宰后24、72 h，μ-Calpain的活性比最初分別下降42%和95%，360 h后則無活性，而宰后貯存對m-Calpain則無影響，但作者用5 mol/L的氯化鈣溶液處理m-Calpain，發現其發生了自溶且活性隨時間的延長出現了與μ-calpain相似的消失規律，因此認為m-Calpain在宰后羊的肌肉細胞中呈無活性狀態主要是由于鈣離子濃度不能使其發生自溶。另外，Delgado等[5]研究也發現普通羊背最長肌中的μ，m-Calpain在宰后的活性變化，發現μ-Calpain在宰后1、3的活性分別降至宰后的42.6%、19%，而在第10天時已不能檢測到μ-Calpain的酪蛋白的水解活性。m-Calpain在宰后3、10 d則分別降至宰后的86%、76%，而酪蛋白水解活性與沒有變化。鈣蛋白酶活性與動物品種[2]、動物性別[6]、營養水平[7]等因素相關，因此在不同研究中，各研究者得出的鈣蛋白酶活性變化速率存在差異。

3 Calpain在宰后肌肉嫩化中的作用

3.1 對Costameres的降解

Costameres是存在于肌細胞中的一些絲狀的結構蛋白質，起著連接肌原纖維和肌纖維膜、穩定肌細胞結構的作用。在骨骼肌肌細胞中，位于肌膜附近的肌原纖維在每Ⅰ帶水平上都有costameres結構。它主要由vinculin、desmin和dystrophin組成[8]。

Thompson等[9]用體內法和體內法同時研究發現costameres是Calpains的良好底物。Taylor等[10]通過電鏡發現，在4 ℃下存放的牛股二頭肌（BF）和半膜肌（SM）的肌纖維中，Costameres在24 h內部分已被破壞，72 h則完全被破壞，蛋白質印跡分析也證實了Costameres的兩種重要蛋白desmin和vinculin幾乎完全降解，而此時正是肌肉嫩化的主要時期，因此認為肌肉早期嫩化與costameres的降解高度相關。Costmeres的主要作用是使肌細胞膜與肌纖維聯系在一起，Taylor等[11]發現牛肌細胞膜在宰后24 h由0 h時的內陷狀態復原，二者相互分離表明Costameres在24 h內已經開始被Calpains降解，所有肌細胞中Costameres連接作用的完全消失是在宰后72 h內，因此表明宰后肌肉Costameres降解的時間主要是宰后24～72 h。Hwan等[12]利用蛋白印跡技術檢測牛半腱肌在宰后嫩化過程中肌纖維蛋白降解的試驗中也發現desmin宰后的降解，但是其降解時間是發生在宰后72 h與Taylor等[11]的24～72 h有差異，造成不一致的可能原因是試驗肌肉不同。即半膜肌中的desmin降解速率快于股二頭肌中的desmin降解速率。

3.2 對N2線和肌原纖維間desmin和M-filaments的降解

N2線主要由nebulin和titin組成，二者都穿過Ⅰ區并將N端和C端分別固定于Z線上，N2線的作用是聯系肌纖維內粗肌絲和細肌絲。而肌原纖維間desmin和M-filaments也是維持肌細胞結構完整而必需的結構蛋白。

Goll[13]通過對肌纖維顯微結構的觀察發現N2線在宰后冷儲中，首先被降解，由于N2線固定于Z線，因此在于Z線附近也發現有裂縫；作者發現肌細胞中的另一個超微結構的改變是在肌細胞內相鄰肌原纖維彼此分離呈游離狀態。在正常情況下，相鄰肌細胞靠處于Z線的demin和處于M線的M-filaments 連接，因此推測宰后肌肉嫩化過程中相鄰肌細胞間desmin和M-filaments被calpain降解。Taylor等[11]通過蛋白印跡技術分析在宰后肌肉儲存過程中，發現在宰后24 h內已大約有25%的骨骼肌nebulin降解，而titin在0 h已開始降解，但主要的降解時期是宰后24～72 h，它由T1型降解為較小分子量的T2型，因此宰后肌肉中titin和nebulin的降解與肌肉的早期嫩化顯著相關。

4 動物營養對Calpain活性的調控

肌肉生長速率的加快是肌肉蛋白質周轉加快的表現，而蛋白質周轉是肌纖維蛋白降解和沉積的比值，其中的肌纖維蛋白的降解是受calpain嚴格調控的。因此，在宰前通過營養調控肌肉沉積速率進而調節了肌細胞中的calpain量，以便為宰后肌肉的嫩度提高提供新的途徑。

4.1 飼喂制度

Kristensen等[14]研究由四種不同飼喂制度而造成不同生長速率的豬，在宰后calpain的活性及肌肉的嫩度的變化。在28d-90d-165d試驗期間，四種不同飼喂方式分別為全程自由采食（AA），全程限飼（ RR），前期自由采食后期限飼（AR）和前期限飼而后期則自由采食（RA）。通過測定μ-Calpain、m-Calpain及宰后肌肉1、4 d的剪切力發現在生長后期出現了明顯的補償生長的RA處理組的豬μ-Calpain、m-Calpain的活性與AA組的豬無差異，但這兩個處理的豬Calpain活性都高于RR和AR處理組。

4.2 營養水平

唐仁勇等[7]報道宰前添加天冬氨酸鎂對豬μ-Calpain mRNA含量的影響，發現宰前9 d添加天冬氨酸鎂能提高μ-Calpain mRNA的表達量，改善了宰后豬背最長肌24 h的嫩度，而張勇等[15]研究了日糧不同蛋白質水平對豬骨骼肌鈣蛋白酶基因表達及嫩度的影響，結果表明日糧不同蛋白質水平對μ-Calpain mRNA在骨骼肌中的表達量有顯著影響（P<0.01），其表達量隨日糧蛋白質水平的升高而下降，致使肌肉嫩度降低。

參考文獻：

[1] SAVELL JW， SHACKELFORD S D. Significance of tenderness to the meat industry[J]. Proc Recip Meat Conf， 1992（45）：43-46.

[2] SHACKELFORD S D， WHEELER T L， Meade M K. Consumer impressions of Tender Select beef[J]. Anim Sci，2001（79）：2605-2614.

[3] KOOHMARAIE M， WHIPPLE G， KRETCHMAR D H. Postmortem proteolysis in longissimus muscle from beef， lamb and pork carcasses[J].Anim Sci，1991（69）：617-624.

[4] VEISETH E， SHACKELFORD S D， WHEELER T L. Effect of postmortem storage on mu-calpain and m-calpain in ovine skeletal muscle[J]. Anim Sci，2001，（79）：1502-1508.

[5] DELGADO E F， GEESINK G H， MARCHELLO， et al. Properties of myofibril bound calpain activity in longissimus muscle of callipyge and normal sheep[J].Anim Sci，2001（79）：2097-2107.

[6] MORGAN J B， WHEELER T L， KOOHMARAIE M， et al.Meat tenderness and the calpain proteolytic system in longissimus muscle of young bulls and steers[J]. Anim Sci，1993，71： 1471-1476.

[7] 唐仁勇，陳代文，張克英，等. 宰前短期添加天冬氨酸鎂和維生素D3對育肥豬肉品質及μ-Calpain與Calpastatin基因表達的影響[J].中國畜牧雜志， 2008，4428-31.