石榴F3’H基因PCR反應體系的研究

陶吉寒　招雪晴等

摘要：從石榴（Punica granatum L.）泰山紅品種的花瓣中提取總RNA并反轉錄得到cDNA。設計簡并引物對石榴類黃酮3-羥化酶（F3H）基因進行PCR擴增，篩選合適的引物及退火溫度。結果表明，適合石榴F3H基因擴增的正反向引物分別為5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCDGCWATGGCCCAHAYRTT-3′。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；72 ℃保溫10 min。

關鍵詞：石榴（Punica granatum L.）；F3H基因；PCR

中圖分類號：S685.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2168-03

石榴（Punica granatum L.）為石榴科落葉灌木或小喬木，在中國已有兩千多年的栽培歷史，在長期的自然選擇和人工栽培過程中形成了豐富的遺傳多樣性[1，2]。石榴不僅是人們喜愛的傳統水果，也是一種優良的園林綠化樹種。石榴花朵艷麗，其花瓣有單瓣、復瓣、重瓣、臺閣等不同花型，紅、粉紅、白、黃等不同花色[3]，觀賞價值極高。目前對石榴AFLP[1，2]、ISSR[4]、RAPD[5]、SARP[6]等分子標記的研究較多，而對控制石榴花色形成相關基因的報道較少。類黃酮3-羥化酶（F3H）屬于細胞色素P450單加氧酶家族，在花色苷生物合成途徑中發揮重要作用，具有催化多種依賴NADPH或NADH的底物氧化反應的功能[7]，可將4，5，7-三羥基黃烷酮（Naringenin）和二氫堪非醇（Dihydrokaempferol， DHK）分別轉化成圣草酚（Eriodictyol）和二氫櫟精（Dihydroquercetin，DHQ）后形成不同顏色的花色苷，使植物表現出不同的花色[8]，克隆F3H基因可為研究石榴的花色形成提供分子基礎。本研究以石榴泰山紅品種的花瓣為材料，對F3H基因的PCR擴增條件進行優化，從而建立高效特異的石榴F3H基因PCR擴增體系，為后續石榴花色形成機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年5～6月從山東省果樹研究所石榴種質資源圃采集泰山紅石榴的花瓣，放入液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 方法

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取結果

2.2 引物對的篩選

2.3 退火溫度的優化

3 討論

PCR是基因分離、克隆和核酸序列分析等分子生物學研究的基礎，影響PCR產物特異性和得率的因素很多[9]，如退火溫度、退火和延伸時間、引物和酶的濃度、Mg2+的濃度等，所以對不同的基因來說，應根據實際情況對PCR條件進行優化。

目前石榴F3H基因序列還沒有報道，因而無法獲得該基因的特異引物。簡并PCR技術利用引物序列的6個簡并性堿基，擴增位點多，沒有物種特異性，與DNA的復雜程度無關[10]。本研究以GenBank中登錄的其他物種的F3H基因保守區域的核苷酸序列為參考，設計不同的簡并引物進行PCR擴增，由于引物的簡并性，使得擴增的特異性有所降低，因而必須對使用的引物進行篩選，以獲得最佳擴增引物。

在PCR擴增過程中，退火溫度取決于引物長度、序列、堿基組成和引物的濃度[11]。較高的退火溫度會使模板復性的準確性提高，從而提高擴增的特異性，但是溫度過高會使得引物與模板親和力變小，以致不能結合，得不到擴增產物；而溫度過低又有可能出現非特異性擴增。另外，由于理論預測與實驗差別較大，所以不同的引物適宜的退火溫度不同，在PCR擴增時有必要進行最佳退火溫度的確定。

本研究在對PCR引物進行篩選時，發現F1R2和F2R2這兩對引物均能擴增得到目的片段，其中F1R2引物在50 ℃的退火溫度下的PCR擴增產物具有特異性，但產量很低，不利于后續實驗的進行。而F2R2引物在50 ℃的退火溫度下有非特異性擴增產物，通過提高退火溫度減少非特異性擴增，取得了較好的擴增效果。實驗結果表明，適合石榴花瓣F3H基因PCR擴增的正反向引物分別為5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCD

GCWATGGCCCAHAYRTT-3′，PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；72 ℃保溫10 min。

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