與番茄抗葉霉病基因Cf—16連鎖的分子標記篩選及種質資源鑒定

李寧　姚明華等

摘要：以攜帶抗葉霉病基因Cf-16的番茄（Lycopersicon esculentum）材料Ontario 7816為母本，感病材料07880為父本配置雜交，以親本及其F2代分離群體為研究材料，采用SSR和AFLP技術篩選與抗葉霉病基因Cf-16連鎖的分子標記。結果表明，鑒定到與Cf-16基因連鎖的SSR標記1個、AFLP標記5個，并將AFLP標記E-ACA/M-TCG219轉化為AFLP-SCAR標記并應用于種質資源篩選，篩選出3份攜帶Cf-16基因的番茄材料，為抗葉霉病育種提供了基礎。

關鍵詞：番茄（Lycopersicon esculentum）；葉霉病；Cf-16基因；SSR標記；AFLP-SCAR標記

中圖分類號：S641.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2066-04

葉霉病是由褐孢霉屬（Fulvia）褐孢霉[Fulvia fulva （Cooke） Cif.]引起的番茄（Lycopersicon esculentum）主要病害之一，既影響番茄產量又影響果實品質，從而造成經濟損失[1]。選育和推廣抗病品種是解決番茄葉霉病最為經濟、有效和環保的途徑之一。但是防治番茄葉霉病是十分困難的，主要是由于番茄葉霉病病原菌的生理小種分化十分迅速，育成含有新的Cf抗病基因的栽培品種不久后，就會分化出侵染該基因的新致病生理小種。目前，國內番茄抗葉霉病育種中普遍應用的Cf-4抗病基因已被侵染，侵染Cf-9抗病基因的生理小種在華北地區也被檢測出來[2]。已報道至少有24個抗葉霉病基因被發現，它們能夠克服不同的葉霉病生理小種[3]，因而利用新的、具有較高抗性的Cf抗病基因將是我國葉霉病抗病育種的重要目標之一。番茄與葉霉病病原菌的互作遵循“gene-for-gene”學說[4]，開展番茄抗葉霉病育種工作要根據當地葉霉病病原菌生理小種的分化情況，利用抗病基因對不同生理小種的抗病性進行鑒定。傳統的人工接種抗病性鑒定不僅需要較長的時間和花費較多的人力物力，直接影響多抗性新材料及新品種的選育進程，而且還易受環境條件、接種技術等影響，從而導致鑒定結果不穩定。抗病育種是一個長期策略，合理利用抗病種質資源保持持久抗性十分重要。分子標記技術為快速篩選鑒定抗病基因提供了有力手段，利用分子標記技術對番茄葉霉病抗病基因的研究方面已取得較大進展，Cf-4和Cf-9基因緊密連鎖位于1號染色體短臂的Milky Way位點；Cf-2和Cf-5基因緊密連鎖位于6號染色體短臂，Cf-6基因同樣位于6號染色體短臂；Cf-11、Cf-12和Cf-19基因也分別被定位于染色體上[5-10]。

本研究應用SSR和AFLP標記方法對Cf-16基因進行分子標記研究，并將獲得的與Cf-16基因連鎖的AFLP標記轉化為SCAR標記，從而為開展Cf-16基因的相關分子標記輔助育種和基因克隆奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄抗葉霉病材料Ontario 7816（含Cf-16基因，不含其他抗葉霉病基因）由北京市農林科學院蔬菜研究中心提供；番茄感病親本材料07880（不含任何抗葉霉病基因），親本雜交（Ontario 7816為母本，07880為父本）的F1代，F1代自交獲得的F2代分離群體，番茄感葉霉病通用對照品種Money Maker（含Cf-0基因），番茄葉霉病優勢生理小種1.2.3.4[11]以及64份番茄自交系種質均由東北農業大學番茄研究所收集、分離和鑒定。

1.2 方法

1.2.1 接種方法及病情分級標準 接種采用噴霧接種法[10]。接種苗齡為4片真葉期，濃度為107個孢子/mL。接種后3 d內保持相對濕度100%，溫度22～25 ℃，使葉霉菌進行繁殖，3 d后相對濕度降至80%保持11 d，接種14 d后調查發病情況。

單株分級標準：0級——無癥狀；1級——接種葉有直徑1 mm的白斑或壞死斑；3級——接種葉有直徑2～3 mm的黃化斑，葉背面有少量白色霉狀物；5級——接種葉有直徑5～8 mm的黃化斑，葉背面有許多白色霉狀物；7級——接種葉有直徑5～8 mm的黃化斑，葉背面有黑色霉狀物，同時上部葉片也有黑色霉狀物；9級——接種葉病斑上有大量孢子，上部葉片也有孢子形成。

1.2.2 葉片基因組DNA的提取及抗、感池的建立 葉片基因組DNA的提取采用CTAB法[12]，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，分光光度計測定DNA的濃度，調整各樣品DNA濃度為50 ng/μL。從F2代分離群體中隨機選取10株抗病植株和感病植株，參照Michelmore等[13]的混合分組分析法，建立抗病池和感病池，各取等量的DNA混合，對在雙親間表現多態性的引物進行進一步的篩選。

1.2.5 AFLP-SCAR標記的轉化 用滅菌的手術刀片切割目標差異條帶，溶解于30 μL ddH2O中，37 ℃過夜，12 000 r/min離心10 s，以上清液為模板進行PCR擴增，擴增體系同選擇性擴增體系。對擴增產物的目標片段進行回收，克隆于pEASY-T1載體，轉化后測序。根據測序結果及EcoRⅠ和MseⅠ核心引物序列設計SCAR引物，并對兩親本、混合基因池及F2代單株進行PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 人工接種抗性鑒定及遺傳分析

2.2 SSR分析

2.3 AFLP分析

2.4 AFLP-SCAR標記的轉化

2.5 種質資源鑒定

對64份番茄自交系種質進行人工接種鑒定，共篩選出16份抗葉霉病材料，應用獲得的AFLP-SCAR引物進行分子鑒定（表1），共鑒定出3份含有Cf-16基因的抗葉霉病番茄材料分子標記檢測和人工接種鑒定的結果完全吻合，說明獲得的分子標記是可靠的，不僅在分子水平上驗證了分子標記的實用性與準確性，而且完全可以在番茄抗葉霉病育種中應用。

3 小結與討論

20世紀30年代以來，加拿大和美國就開始番茄葉霉病抗病育種研究，并從栽培番茄及野生番茄中篩選出多個抗源應用于番茄抗病育種。目前，國內育成的抗葉霉病番茄品種應用的是Cf-4和Cf-9基因。從國內各地區關于番茄葉霉病病原菌生理小種分化的監測結果來看，能夠侵染Cf-4基因的生理小種1.2.3.4是我國大部分地區的優勢生理小種，Cf-4基因已經喪失抗性，并發現侵染Cf-9基因的生理小種1.2.3.4.9[2]。利用具有較高抗性的基因是我國葉霉病抗病育種的重要目標。抗病育種是一個長期工作，因而提前對較高抗性、且尚未應用的葉霉病抗病基因Cf-16進行研究，建立分子標記輔助選擇體系，在時間上獲得主動權，為應對新分化的致病性更強的番茄葉霉病生理小種做好準備是十分重要的工作。

分子標記技術的應用使我們能夠快速地進行染色體定位和分子標記輔助選擇。應用SSR標記方法，根據與Cf-16基因連鎖的SSR標記Tom144-145，將Cf-16基因定位于11號染色體，與Kanwar等[17]通過經典遺傳定位的結果相同。AFLP標記技術同樣廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、分子標記輔助選擇等。本研究中共獲得5個與Cf-16基因連鎖的標記，其中標記E-ACA/M-TCG219與目標基因的遺傳距離為4.7 cM，小于5.0 cM，能夠應用于分子標記輔助選擇。但是，AFLP標記方法的操作比較復雜，并且需要經過酶切、連接等步驟，操作昂貴，不適于大規模及大群體的選擇使用，因此，本研究試圖將AFLP標記轉化為以PCR為基礎的SCAR標記。根據測序后獲得的序列信息，將E-ACA/M-TCG219標記轉化為SCAR標記，經F2分離群體人工接種鑒定驗證，吻合率為90%以上，表明篩選出的AFLP-SCAR標記能夠應用于分子標記輔助選擇育種。

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