安徽水稻黑條矮縮病毒基因組片段S10的cDNA克隆及其序列分析

張海珊等

摘 要：從采自安徽省肥西縣發病的水稻材料中提取水稻黑條矮縮病毒dsRNA，利用RT-PCR獲得了病毒基因組片段S10的cDNA克隆，并測定其全序列。結果表明：S10全長1801bp，含有一個ORF；核苷酸與氨基酸序列同源性比較表明，其與浙江的RBSDV（AY050488）最接近，分別為99.2%和99.6%；與日本的RBSDV（D00606）分別為95.1%和97.5%。

關鍵詞：水稻黑條矮縮病毒；cDNA克隆；S10片段；序列分析

中圖分類號 S435.11 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）09-31-02

水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf Fijivirus，RBSDV）是呼腸孤病毒科（Reovirdae）斐濟病毒屬（Fijivirus）的成員[1]，該病毒基因組是由10條雙鏈RNA組成，按照其在凝膠上的遷移率由慢到快依次命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10[2]。在自然界中，水稻黑條矮縮病毒只能通過攜帶病毒的灰飛虱（Laodelphax striatellus）以持久性的方式傳播[3]。該病毒主要侵染水稻引起水稻黑條矮縮病，同時也可侵染小麥、玉米，引起玉米粗縮病和小麥綠矮病等病害[2]，是一種十分重要的作物病毒。20世紀90年代后期，RBSDV在浙江省暴發流行，并迅速在長江流域中東部稻作區蔓延，成為水稻生產上的毀滅性病害，造成了巨大的經濟損失[4]。本文報道了采自安徽省肥西縣的RBSDV水稻分離物基因組片段S10的cDNA克隆及其全序列分析的研究結果。

1 材料與方法

1.1 材料 2010年7月從安徽省肥西縣采集具有典型RBSDV侵染癥狀的水稻樣本，于-80℃保存備用。

1.2 引物設計 根據已報道的RBSDV S10基因組序列設計兩對引物P1（擴增1-616位點的片段）和P2（擴增167-1801位點的片段），由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下：P1 F1：5AAGTTTTTTTCCTCACCCATA3，R1：5CCATTTGAGCAGGAACTTCAC3；P2 F2：5TCAAAGCGCCCCACGTTGC3；R2：5GACAATAGCTGAATTTCCCCCTA3。

1.3 總RNA提取及RT-PCR擴增 取0.1g凍存水稻病葉，于液氮中充分研磨成粉，然后用Trizol試劑（上海生工生物工程有限公司公司產品）提取病葉總RNA，方法按公司提供的產品說明書進行。取8μL RNA模板與1μL R2（下游引物）混勻后，于95℃處理5min后迅速冰浴。然后按以下反應體系（25μL）進行逆轉錄：5μL 5ⅹ反轉錄緩沖液，2.5μL Dntp，1μL Rnase抑制劑和AMV反轉錄酶3μL，加0.1%DEPC處理的雙蒸水至25μL，42℃反應1h，隨后95℃加熱5min，立即冰浴，合成cDNA第一鏈。PCR擴增在50μL反應體系中進行，反應包括2μL反轉錄產物，5μL 10ⅹPCR buffer，3μL MgCL2（25mmol/L），1μLdNTP Mixture（10nmol/L），上下游引物各1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），ddH2O36.5μL。充分混勻后，進行PCR反應，反應條件如下：94℃變性3min后，94℃30s，58℃45s，72℃1min，共30個循環。最后72℃延伸10min。

1.4 PCR產物克隆及序列測定 PCR產物純化后，經電泳檢測為目的片段后，直接連接于pMD18-T載體（TaKaRa）上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，藍白斑篩選重組子，PCR擴增和雙酶切鑒定陽性重組子。陽性克隆委托上海生工生物工程有限公司進行測序、拼接，獲得S10 cDNA全序0。

2 結果與分析

2.1 安徽RBSDV S10兩段序列的擴增 利用P1和P2這兩對引物，通過RT-PCR的方法從水稻黑條矮縮病感病葉片總RNA中擴增得到600bp和1600bp左右的特異產物（如圖1），片段大小與引物設計大小相符。經回收后克隆到pMD18-T載體，并轉化大腸桿菌。陽性克隆用于DNA序列測定，并進行拼接。

2.2 安徽RBSDV S10 cDNA全序列分析 通過片段拼接獲得安徽省水稻黑條矮縮病的病毒分離物基因組第10組分（S10）cDNA克隆。序列分析結果顯示：S10全長1801bp，含有一個ORF開放閱讀框，編碼一個分子量約為63.1kD的蛋白質。序列分析表明所測的病毒分離物S10在總長度、G/C含量、非編碼區長度和開放閱讀框（ORF）等基因組織形式與報道的RBSDV相符合。核苷酸與氨基酸序列同源性比較發現其與浙江的RBSDV水稻分離物S10基因（AY050488）最接近，分別為99.2%和99.6%；與日本的RBSDV（D00606）分別為95.1%和97.5%；與意大利的MRDV（L76560）相對較遠一些，分別為86.8%和91.6%。S10序列分析結果證明斐濟病毒屬RBSDV為引起我省水稻黑條矮縮病的病原之一。

3 討論

自2008年以來，水稻黑條矮縮病在安徽省多個地區發生危害，我們先后對我省太湖縣、居巢區、肥西縣、全椒縣等地水稻病毒病發生狀況進行了調查，并采集了發病水稻病株。本研究系從我省肥西縣水稻上克隆了RBSDV S10片段序列。序列分析發現，其與多個來自于浙江的RBSDV 的S10序列相似性高達95.2%～99.2%，推測安徽省肥西縣的RBSDV病毒與浙江分離的病毒親緣關系較近。有關安徽省水稻黑條矮縮病發生流行的研究報道較多，但有關分子方面的研究只有李祥宇等[5]對安徽省內RBSDV的S9部分片段序列進行過研究。通過對安徽省RBSDV各個組分的克隆及序列分析，可以進一步認識RBSDV基因組功能結構，有助于深入研究水稻黑條矮縮病毒在安徽省不同作物上的侵染危害、演化、分布、流行規律，為防治RBSDV提供理論依據。

參考文獻

[1 ] Boccardo G，Milne R G. Plant reovirus group [J]. CMI/ AAB Discriptions of Plant Viruses，1984：294.

[2] 張恒木，雷娟利，陳劍平，等.浙江和河北發生的一種水稻、小麥、玉米矮縮病是水稻黑條矮縮病毒引起的[J].中國病毒學，2001，16（3）：246-251.

[3] Shikata E，Kitagawa Y. Rice black-streaked dwarf virus： Its properties，morphology and intracellular localization. Virology，1977，77（2）：826-842.

[4] Wang H D，Chen J P，Wang A G，et al Studies on the epidemiology and yield losses from rice black streaked dwarf disease in a recent epidemic in Zhejiang province，China[J]. Plant Pathology，2009，58（5）：815-825.

[5]李祥宇，閆德龍，鄭兆陽，等.安徽省水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的分子檢測和序列分析[J].安徽農業大學學報，2013，40（1）：146-151. （責編：陶學軍）