水貂阿留申病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備

姜亦飛　于可響　林樹乾等

摘 要：本研究利用PCR方法從水貂阿留申病毒相關病料中擴增出VP2蛋白部分基因，并進行原核表達，成功獲得VP2重組蛋白；利用純化的VP2重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞融合，成功獲得3株雜交瘤細胞：1F4F7D9、3E9G3D4和4B8B3F8；分別接種小鼠，間接ELISA檢測結果表明，3組實驗小鼠腹水的單克隆抗體效價均在106以上。

關鍵詞：水貂阿留申病毒；VP2重組蛋白；單克隆抗體

水貂阿留申病（Aleutian mink disease， AD）是一種由阿留申病毒（Aleutian mink disease parvovirus， ADV）引起的水貂自身免疫系統紊亂性疾病，目前在全國范圍內廣泛流行，是當今阻礙養貂業發展的主要傳染病，其主要臨床表現為母貂流產、新生子貂急性肺炎、成年水貂慢性免疫復合物介導的腎小球腎炎等[1]。病毒粒子中的蛋白分為結構和非結構蛋白兩類，其中VP2是ADV的主要免疫原性抗原，是抗原決定簇的載體，與致病性密切相關，是目前研究最多的蛋白，VP2基因也已成為研究ADV毒力、致病性、抗原性和建立檢測方法的首選基因[2～5]。本研究利用重組表達的水貂阿留申病毒VP2蛋白制備出單克隆抗體，為阿留申病毒的鑒定、檢測等研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水貂阿留申病毒相關病料、陽性血清由青島農業大學特種經濟動物教研室提供；骨髓瘤細胞Ag8.653、BALB/c小鼠由北京青元盛康生物醫藥科技有限公司提供。

病毒DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒、IPTG、Ex Taq酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質預染Marker及非預染Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗水貂IgG（HRP標記）購自美國Sigma-ldrich公司；DAB （3，3二氨基聯苯胺）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 引物設計

根據GenBank收錄的ADV全長序列（JN040434.1），選取VP2基因901～1 560 nt區域設計并合成引物。上游引物5′端引入BamHⅠ酶切位點，下游引物5′端引入XhoⅠ酶切位點。引物序列為：

1.3 VP2基因擴增

按照病毒DNA提取試劑盒說明提取病毒DNA，加入滅菌去離子水溶解。PCR反應體系：DNA模板2 μl，10×PCR buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 2 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L 上下游引物各1 μl，Ex Taq 0.5 μl，加滅菌去離子水至50 μl。反應條件：95℃預變性 3 min；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，30個循環； 72℃延伸10 min。取5 μl反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

1.4 表達載體的構建

將擴增出的VP2基因片段回收并克隆至pMD18-T載體中，用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，鑒定為陽性的克隆質粒命名為pMD18-VP2。用BamHⅠ和XhoⅠ分別雙酶切重組克隆質粒pMD18-VP2和pET-28a（+）載體，回收目的片段，16℃連接過夜，轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，鑒定為陽性的質粒命名為pET28a-VP2。將陽性質粒pET28a-VP2轉化BL21感受態細胞，提取質粒，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的質粒送上海博尚生物工程有限公司測序。

1.5 重組表達質粒誘導表達、純化及Western blotting分析

挑取陽性菌于37℃培養待OD600值達到0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續培養5 h。取誘導的菌體，用1×PBS緩沖液懸浮，利用超聲波破碎菌體，離心，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白表達情況。設置pET-28a（+）空載體轉化株作為對照。

取100 ml經IPTG誘導表達的VP2蛋白菌液，按照Ni-NTA SefinoseTM Resin Kit說明書進行純化，然后根據Sambrook等[6]方法進行Western blotting分析，最后加入DAB底物液顯色并拍照。

1.6 單克隆抗體的制備

1.6.1 重組VP2蛋白的準備 誘導表達的VP2蛋白經Ni柱純化后，定量，備用。

1.6.2 免疫小鼠 取健康8周齡BALB/c小鼠5只，足掌注射VP2蛋白免疫，共五次，劑量均為100 μg，首免與等體積弗氏完全佐劑乳化，二免與等體積弗氏不完全佐劑乳化，三、四、五次免疫不用佐劑。首免與二免間隔20 d，二免與三免間隔10 d，第三、四、五次免疫間隔3～7 d不等。五次免疫3 d后尾靜脈采血，利用以表達的VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法測定靜脈血中的抗體效價，選效價高的小鼠進行細胞融合試驗。

1.6.3 雜交瘤細胞株的建立 分離免疫小鼠的脾臟并勻漿制備免疫脾細胞，按常規方法將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合；融合后7～10 d補加1%的HT培養液，用倒置顯微鏡觀測細胞生長情況及有無雜交瘤形成，并作記錄；待集落長到培養孔的1/4～1/3時進行抗體檢測，檢測到陽性孔（即能在其上清液中檢測到特異性抗體）時，作克隆化培養；當陽性孔中的細胞集落很大時，吸出，移入已加有飼養細胞的24孔細胞培養板中繼續培養（陽性克隆的篩選采用以表達的VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法；陽性孔的克隆化培養采用有限稀釋法）。

1.6.4 小鼠腹水型單克隆抗體的生產 選取8～10周齡健康純系雌性BALB/c小鼠12只，設3個雜交瘤細胞組和1個對照組，每組3只，于接種細胞前10 d注射無菌液體石蠟，每只0.5 ml；將雜交瘤細胞從培養瓶上吹下，培養物移入50 ml離心管中，室溫800×g離心5 min，棄上清；用40 ml無菌PBS重懸細胞，離心，棄上清；重懸細胞于5 ml無菌PBS，進行細胞計數，并用臺盼藍拒染試驗檢測細胞活力是否接近100%；加入無菌PBS調整細胞濃度為5×106個/ml，向小鼠腹腔內注射0.5 ml細胞懸液，5 d后開始采集腹水；腹水于室溫下1 500×g離心10 min，收集上清轉移至高速離心管，4℃下15 000×g離心10 min，收集上清，標記好單抗名稱和采集日期，-80℃保存。

腹水效價的測定：腹水從1∶200開始倍比稀釋，利用以表達的VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法測定抗體效價。

2 結果與分析

2.1 VP2基因擴增

提取水貂阿留申病毒DNA，以此為模板進行PCR，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條大小為660 bp左右的片段（圖1），與預期大小相符。

2.4 重組菌的誘導表達及Western blotting分析

重組菌經IPTG誘導后，獲得高效表達，在沉淀中出現30.2 ku左右的目的蛋白條帶（圖4），大小與預期結果相符。純化蛋白經Western blotting分析（圖5），與水貂阿留申病毒陽性血清呈特異性反應，證明表達產物具有良好的抗原性。

2.5 單克隆抗體的制備

細胞融合后，通過ELISA方法篩選到3株能穩定傳代并分泌抗阿留申病毒VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別為1F4F7D9、3E9G3D4、4B8B3F8。將這3株雜交瘤細胞分別注入小鼠腹腔制備腹水，經ELISA檢測，3組實驗小鼠腹水的單克隆抗體間接ELISA效價均在106以上。

3 討論

由于ADV分離十分困難，筆者嘗試過多次病毒分離，但一直未能分離到病毒。因此，采用直接從ADV陽性病料擴增VP2基因的方法，成功擴增出VP2部分基因，并將其克隆至表達載體pET-28a（+）中進行表達，成功獲得重組VP2蛋白，經Western-blotting證明該重組蛋白具有良好的反應原性。

目前，阿留申病毒病作為危害世界養貂業的三大病毒性傳染病之一，在我國許多地區都有不同程度的流行，給我國的養貂業帶來了很大的損失[7]，因此建立敏感、特異、低成本、高通量的血清學檢測方法，用來篩選淘汰發病水貂，建立非感染貂群顯得尤為重要。對流免疫電泳（CIEP）是世界公認的、應用最廣泛的AD檢測方法，但CIEP中的抗原多是臟器抗原、細胞抗原等病毒抗原，病毒的濃縮和純化成本較高，且存在散毒的風險，在應用中有一定的局限性[8]。本研究利用純化的VP2重組蛋白免疫BALB/c小鼠，篩選到3株雜交瘤細胞，并獲得3組單克隆抗體ELISA效價均在106以上的實驗小鼠的腹水，為以單克隆抗體為基礎建立高效的ELISA檢測阿留申病毒的方法奠定了基礎。

參 考 文 獻：

[1] 鄭 全， 王樹志， 王全凱. 水貂阿留申病研究進展[J]. 經濟動物學報， 2002， 6（4）：49-52.

[2] 梁冬瑩， 華育平， 曾祥偉. 水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位區的原核表達[J]. 東北林業大學學報， 2007， 35（6）：39-41.

[3] McKenna R， Olson N H， Chipman P R， et al. Three-dimensional structure of Aleutian mink disease parvovirus： implications for disease pathogencity[J]. J. Virol.， 1999， 73（8）：6882-6891.

[4] Bloom M E， Alexandersen S， Garon C F. Nucleotide sequence of the 5′-terminal palindrome of Aleutian mink disease parvovirus and construction of an infectious molecular clone [J]. J. Virol.， 1990， 64（7）：3551-3556.

[5] Wu W H， Bloom M E， Berry B D， et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in abaculovirus expression system for potential diagnostic use[J]. J. Vet. Diagn. Invest.， 1994， 6（1）：23-29.

[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T， 著. 金冬雁， 黎孟楓， 侯云德， 等譯. 分子克隆實驗指南（第二版）[M]. 北京：科學出版社， 1998， 862-897.

[7] 殷 震，劉景華. 動物病毒學（第二版）[M]. 北京：科學出版社，1997，1162-1165.

[8] 閆喜軍，籍玉林. 我國水貂阿留申病流行現狀、特點及防治技術[J]. 特種經濟動植物，2004， 5：44.