索氏提取—固相萃取—高效液相色譜法檢測(cè)煙熏肉制品中苯并（a）芘

趙冰 李素 戚等

摘 要：采用索氏提取-固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)清真牛肉香腸中的苯并（a）芘含量，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高，回收率可以達(dá)到91%以上，特別是對(duì)于油脂含量較高的食品具有良好的效果，可以推廣到其他肉制品中苯并（a）芘的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：索氏提取；苯并（a）芘；高效液相色譜；固相萃取

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2013）11-0030-03

煙熏肉制品香腸色澤金黃、風(fēng)味獨(dú)特，具有濃郁的煙熏風(fēng)味，同時(shí)具有良好的貯藏性和較長(zhǎng)的貨架期，但是在肉制品的煙熏過(guò)程中，由于煙熏木屑的不完全燃燒或蛋白質(zhì)和脂肪高溫?zé)峤鈺?huì)生成多環(huán)芳烴類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有致癌性[1-2]。其中苯并（a）芘是具有代表性的物質(zhì)，我國(guó)對(duì)肉制品中苯并（a）芘的限量標(biāo)準(zhǔn)是不超過(guò)5?g/kg[3]，

歐盟根據(jù)最新修訂的標(biāo)準(zhǔn)則是根據(jù)苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（β）熒蒽、chrysene四種物質(zhì)的總量不高于30.0μg/kg（自2012年9月日至2014年8月31日），不高于12.0μg/kg（自2014年9月1日起）[4]。

目前，我國(guó)肉制品中苯并（a）芘的檢測(cè)方法主要有兩種，第一是目前的現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB/T5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的測(cè)定》[5]，這種方法是試樣經(jīng)過(guò)皂化后用有機(jī)溶劑提取，在經(jīng)過(guò)液液萃取和柱層析，最后通過(guò)熒光分光光度計(jì)或目測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，這是目前最通用的苯并（a）芘檢測(cè)方法，但是該方法步驟繁瑣，而且需要消耗大量的有機(jī)溶劑；通過(guò)熒光分光光度計(jì)或目測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有待改進(jìn)；是農(nóng)業(yè)行標(biāo)NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（a）芘的測(cè)定：高效液相色譜法》[6]，這種方法通過(guò)多步驟的液液萃取和反萃取收集肉制品中的苯并（a）芘，最后通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，該方法相對(duì)于GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的測(cè)定》步驟簡(jiǎn)單，而且采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確度較高，但是由于在液液萃取和反萃取中，會(huì)損失一定的液體，同時(shí)，如果脂肪含量較高，最終樣品中苯并（a）芘的檢測(cè)結(jié)果會(huì)有較大的影響。

本實(shí)驗(yàn)以煙熏清真牛肉香腸為對(duì)象，研究一種新型的肉制品中苯并（a）芘的檢測(cè)方法，該方法采用索氏提取-固相萃取-高效液相色譜法進(jìn)行前處理和檢測(cè)，步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，為目前肉制品中苯并（a）芘的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉 市售；大豆蛋白、復(fù)合磷酸鹽、卡拉膠、食鹽、蔗糖等輔料購(gòu)于超市。

正己烷、無(wú)水乙醚 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；煙熏木屑 北京美添前景科技有限公司；苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Welchom BaP苯并芘專用固相萃取小柱 （22g/60mL）、WelchomC18E固相萃取小柱（200mg/3mL） 上海月旭科技公司；型號(hào)高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 煙熏清真牛肉香腸加工

以牛肉為原料，將其用絞肉機(jī)絞碎，通過(guò)攪拌機(jī)使其與輔料混勻，使用膠原蛋白腸衣灌腸、打結(jié)，在煙熏爐中50℃干燥30min，然后煙熏40min，溫度50℃。將煙熏后的香腸在90℃蒸煮20min，得到的產(chǎn)品冷卻后真空包裝，最后進(jìn)行巴氏殺菌，產(chǎn)品置于冷庫(kù)中備用。

1.3.2 苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，配制以甲醇為溶劑質(zhì)量濃度為150ng/mL的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取0、2、4、6、8、10mL質(zhì)量濃度為150ng/mL的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至10mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0、5、10、15、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再按照上述的色譜條件測(cè)定峰面積，以6種標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng/mL），對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 83748x+39046（R? = 0.999），說(shuō)明苯并（a）芘在質(zhì)量濃度0～25ng/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.3.3 色譜條件[6]

色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5?m）；流動(dòng)相：乙腈-水（體積比88：12）；流速1.2mL/min；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)384nm，發(fā)射波長(zhǎng)406nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10?L。

1.3.4 固相萃取柱的選擇

根據(jù)苯并（a）芘的極性特點(diǎn)，選用WelchromC18E與Welchrom BaP（氧化鋁）2種不同固定相填料對(duì)苯并（a）芘進(jìn)行富集處理，采用空白加標(biāo)檢測(cè)苯并（a）芘回收率的方法進(jìn)行比較。空白中苯并（a）芘質(zhì)量濃度分別為5ng/mL和20ng/mL。

1.3.5 煙熏清真牛肉香腸中苯并（a）芘的提取

按照國(guó)標(biāo)GB/T 9695.19—2008《肉與肉制品取樣方法》[7]取樣檢測(cè)。由于單個(gè)產(chǎn)品質(zhì)量小于500g，因此選取產(chǎn)品5件，在5～10℃的環(huán)境中將樣品粉碎成肉糜狀，混勻。準(zhǔn)確稱取5g樣品，在40℃索氏提取，回流6h，然后將乙醚與脂肪的混合液40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，分2次加入10mL的正己烷，轉(zhuǎn)移至15mL的離心管中，漩渦振蕩充分混勻，形成樣品提取液，備用[8-10]。然后將固相萃取小柱裝在固相萃取儀上，加入約30mL正己烷活化，流出液棄用；將之前的樣品提取液加入到固相萃取小柱中，然后分4次加入正己烷洗脫，收集洗脫液于茄型瓶中，整個(gè)過(guò)程在常壓下進(jìn)行，自然洗脫；40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用2mL乙腈定容，過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，采用高效液相色譜法分析[11-13]。

1.3.6 方法的精密度和回收率測(cè)定

在已知苯并（a）芘含量的煙熏清真牛肉香腸中分別添加低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行苯并（a）芘的回收率實(shí)驗(yàn)，2個(gè)添加水平分別為5ng/mL和20ng/mL，每個(gè)添加實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定6次[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并（a）芘的標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜色譜圖

2.3 固相萃取柱的選擇

Welchrom C18E的富集效果為77%以上，也具有較好的富集效果，在多環(huán)芳烴類物質(zhì)的固相萃取富集實(shí)驗(yàn)中，Welchrom C18E具有較好的富集效果[15-17]，這也是選其作為對(duì)比的原因。Welchrom BaP固相萃取柱對(duì)苯并（a）芘具有更高的回收率，可以達(dá)到87.6%以上，對(duì)苯并（a）芘的富集效果非常顯著，可以很好的滿足苯并（a）芘檢測(cè)的要求。Welchrom BaP固相萃取柱主要以氧化鋁為固相填料，并進(jìn)行特殊處理，使其對(duì)苯并芘具有非常優(yōu)秀的富集效果。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用Welchrom BaP固相萃取小柱進(jìn)行樣品的富集實(shí)驗(yàn)。

2.3 煙熏清真牛肉香腸中苯并（a）芘的檢測(cè)

Fig.2 HPLC chromatogram of benzo[a]pyrene in sample

對(duì)煙熏清真牛肉香腸中的苯并（a）芘含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，可以看出大約10.8min左右有一個(gè)明顯的吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照可確定為苯并（a）芘，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出樣品中苯并（a）芘的質(zhì)量濃度為9.95ng/mL，經(jīng)過(guò)計(jì)算可知，煙熏清真牛肉香腸中苯并（a）芘的含量為1.99?g/kg。

2.4 精密度和回收率分析

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用索氏提取-固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)煙熏清真牛肉香腸中的苯并（a）芘，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高，特別是對(duì)于油脂含量較高的食品具有良好的效果[18-20]，由于樣品中含有脂肪和瘦肉，而苯并（a）芘易溶于乙醚，因此通過(guò)索氏提取同時(shí)提取肉制品中的油脂和苯并（a）芘，再通過(guò)固相萃取的方式將油脂中的苯并（a）芘提取出來(lái)，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，具有良好的檢測(cè)效果。

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