響應(yīng)面法優(yōu)化豬血紅蛋白抗菌肽的制備工藝

潘曉倩 成曉瑜 張順亮等

摘 要：以豬血紅蛋白為原料，利用篩選出的蛋白酶水解制備抗菌肽，以酶解液抑菌率和水解度為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)對(duì)酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間3個(gè)主要工藝參數(shù)進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，建立數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，胰蛋白酶最適合水解豬血紅蛋白制備抗菌肽，其最佳條件為酶解溫度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解時(shí)間5.19h，酶解產(chǎn)物抑菌率的理論預(yù)測(cè)值89.70%，實(shí)際測(cè)量值90.32%。可見，利用胰蛋白酶水解豬血紅蛋白能夠得到抑菌活性較高的酶解產(chǎn)物，且該模型能夠較好的預(yù)測(cè)抗菌肽制備最佳工藝條件。

關(guān)鍵詞：豬血紅蛋白；抗菌肽；酶解；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2013）11-0001-05

抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，多數(shù)是一類分子質(zhì)量小于10kD，帶有正電荷，在鏈長(zhǎng)、序列及結(jié)構(gòu)方面具有多樣性的兩親性肽類[1-2]。抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高、安全高效等諸多優(yōu)點(diǎn)，食物源蛋白抗菌肽的制備成為生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[3-4]。目前抗菌肽的制備方法有：從動(dòng)植物組織中直接提取法、化學(xué)合成法、基因工程法和酶解法。因酶解法具有反應(yīng)條件溫和、過程容易控制等諸多優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是大批量制備抗菌肽最有前途的方法[5-6]。因酶在剪切肽鍵時(shí)具有一定特異性，當(dāng)選取的酶解底物不同時(shí)，也應(yīng)選取不同種類的酶進(jìn)行水解以獲得抗菌性。如Pellegrini等[7]用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解牛乳α-乳清蛋白均可以得到抗菌組分，而用胃蛋白酶水解得到的多肽組分則無抗菌性。吳林澤等[8]發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶酶解羅非魚下腳料所得粗肽組分對(duì)金黃色葡萄球菌具有很好的抗菌性。

目前，我國(guó)生豬屠宰加工產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，2012年，我國(guó)生豬出欄69628萬頭，增長(zhǎng)5.2%，豬肉產(chǎn)量達(dá)到5335萬噸，增長(zhǎng)了5.6%[9]。豬血是生豬屠宰加工過程中的主要副產(chǎn)物之一，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，素有“液態(tài)肉”之稱[10]，我國(guó)豬血資源非常豐富，但利用率低，不超過10%，如被加工成血粉作為飼料添加劑，用于生化制藥中血紅素、蛋白胨的生產(chǎn)，這些產(chǎn)品附加值低，而大多數(shù)作為廢棄物直接排出，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[11]。歐美、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家將豬血開發(fā)成肽類試劑、肽類藥物等多種功能食品及食品添加劑，普遍推廣，利用率達(dá)50%以上[12]。因此，以豬血為底物開發(fā)生物活性肽，可以提高生豬屠宰加工企業(yè)產(chǎn)品附加值，顯示出巨大的市場(chǎng)前景[13]。

本實(shí)驗(yàn)以豬血紅蛋白抗菌肽復(fù)合物為研究對(duì)象，選取最佳酶類進(jìn)行水解，并以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化抗菌肽制備的酶解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬血采自北京資源集團(tuán)；金黃色葡萄球菌 中國(guó)肉類食品綜合研究中心檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室。

NaOH、鹽酸、乙醇、NaCl（分析純） 北京化學(xué)試劑廠；甲醛溶液（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)37.0%～40.0%） 西隴化工股份有限公司；中性蛋白酶（枯草芽孢桿菌）、堿性蛋白酶（枯草桿菌）、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶（米曲霉） 諾維信（中國(guó)）投資有限公司；胰蛋白酶（胰臟）、木瓜蛋白酶（木瓜）、胃蛋白酶（豬胃） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 北京久潤(rùn)天誠(chéng)科技發(fā)展有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀 北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；PB-10型數(shù)顯酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SL502N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；202A-0恒溫干燥箱 上海和盛有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；F1-45型恒溫培養(yǎng)箱、G154DWS濕熱滅菌鍋 日本三洋公司；CLW-002中空纖維超濾組件 北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；LM-125中空纖維超濾試驗(yàn)裝置 北京旭成超濾設(shè)備廠；LGJ-30D冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測(cè)定

采用Folin-酚法[14]。

1.3.2 豬血紅蛋白的制備[15]

屠宰過程中采集新鮮豬血，并迅速加入質(zhì)量濃度為5g/L的檸檬酸鈉抗凝，4℃保存。將新鮮豬血在4℃、8000r/min離心10min，收集下層沉淀，以獲得紅血球及血漿；并加入同等體積的蒸餾水，超聲波細(xì)胞破碎輔助溶血20min，然后在4℃、4000r/min離心10min，得到血紅蛋白溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 豬血紅蛋白酶解物的制備

取適量血紅蛋白溶液，在不同水解酶適宜條件下加入酶制劑進(jìn)行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并且通過滴加1mol/L NaOH溶液或HCl溶液維持體系pH值，不同蛋白酶酶解適宜條件見表1。酶解結(jié)束后，沸水浴10min，冷卻，調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，8000r/min離心15min，獲得上清酶解液4℃冷藏備用。

1.3.4 豬血紅蛋白酶解物分離及脫色[16]

采用中空纖維超濾設(shè)備，選取截留分子質(zhì)量為10kD的纖維柱對(duì)豬血紅蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離及脫色，以除去大分子蛋白類物質(zhì)，然后將分離物冷凍干燥、―20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 水解度的測(cè)定

水解度是衡量蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)之一，水解度越大，表明蛋白質(zhì)水解越徹底，游離氨基酸的含量越高。總氮測(cè)定采用微量凱氏定氮法[17]；游離氨基氮測(cè)定采用甲醛滴定法[18]。

1.3.6 抗菌肽抑菌率的測(cè)定

采用活菌計(jì)數(shù)法[19]，略作修改。將金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，調(diào)整細(xì)菌最終菌落數(shù)為2.0×103CFU/mL，吸取細(xì)菌培養(yǎng)物200μL至無菌Eppendorf管中，共2管，1管為實(shí)驗(yàn)管，1管為對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)管中加入800μL經(jīng)0.45μm濾膜過濾的質(zhì)量濃度為25mg/mL的豬血紅蛋白抗菌肽，終體積為1mL；對(duì)照管中加入800μL無菌生理鹽水。將各管中液體混勻后，于37℃條件振蕩孵育60min后取200μL涂布于平板計(jì)數(shù)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h后，觀察并紀(jì)錄每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量。根據(jù)稀釋度和接種量計(jì)算出每管原液中的細(xì)菌數(shù)量，按下述公式計(jì)算抑菌率：

1.3.7 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

以酶解液的水解度和對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為指標(biāo)，分別研究酶解時(shí)間、溫度、加酶量3個(gè)主要工藝參數(shù)對(duì)酶解效果的影響。

1.3.8 酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.0軟件采用3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，考察酶解時(shí)間、加酶量和酶解溫度這3個(gè)單因素及交互作用對(duì)酶解效果的影響。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是經(jīng)過3次平行試驗(yàn)得到的平均值，Excel 2007 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤并制圖，使用Design Expert 8.0分析響應(yīng)面數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳水解酶的選擇

不同水解酶酶解豬血紅蛋白得到的酶解液抑菌效果差異很大，其中堿性蛋白酶和胰蛋白酶的效果較好，抑菌率分別達(dá)到82.62%和88.42%，而風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解產(chǎn)物則沒有任何抑菌效果，甚至還會(huì)促進(jìn)菌的生長(zhǎng)，其原因可能與酶解底物特異性及酶的作用肽鍵具有特異性有關(guān)，當(dāng)選取的酶解底物不同時(shí)，也應(yīng)選取不同種類的酶進(jìn)行水解以獲得抗菌性。同時(shí)，由表2還可看出，在用不同水解酶作用時(shí)，其抑菌效果的好壞與水解度的高低沒有直接關(guān)系，考慮本實(shí)驗(yàn)以抗菌肽的制備為目的，因此選擇胰蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 胰蛋白酶水解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對(duì)酶解液抑菌率和水解度的影響

在加酶量3000U/g，pH值調(diào)至8.0的條件下，分別在30、35、40、45、50、55℃的溫度下酶解5h，考察不同酶解溫度對(duì)酶解效果的作用。由圖2可知，當(dāng)酶解溫度在30～50℃范圍內(nèi)升高時(shí)，酶解液抑菌率和水解度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而當(dāng)酶解溫度升至55℃時(shí)，抑菌率和水解度均開始下降。在一定溫度范圍內(nèi)的升溫有助于酶活性的增加，從而提高酶解效率，但超出這個(gè)范圍就會(huì)降低酶的活性。同時(shí)，血紅蛋白水解程度越大，水解產(chǎn)物的抑菌效果就越好，二者變化趨勢(shì)相近，這與胡志和等[20]在水解酪蛋白制備抗菌肽時(shí)所得的結(jié)論相同。

2.2.2 加酶量對(duì)酶解液抑菌率和水解度的影響

在酶解溫度50℃，pH值調(diào)至8.0的條件下，分別在加酶量為1000、1500、2000、2500、3000、3500U/g的條件下酶解5h，考察不同加酶量對(duì)酶解效果的作用。由圖3可知，當(dāng)加酶量在1000～3000U/g的范圍內(nèi)增加時(shí)，抑菌率和水解度都快速增加，當(dāng)達(dá)到3500U/g時(shí)，兩者均有所下降。原因可能是當(dāng)?shù)孜镞^量時(shí)，加酶量的增加能促進(jìn)水解，進(jìn)而產(chǎn)生更多的活性肽，抑菌率增加，但加酶量繼續(xù)增加導(dǎo)致酶過量，可能會(huì)導(dǎo)致活性肽過度水解成為無活性小片段或者造成酶的自身水解，降低酶活性。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解液抑菌率和水解度的影響

在加酶量3000U/g、酶解溫度50℃、pH值調(diào)至8.0的條件下，分別酶解1、2、3、4、5、6h，考察不同酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的作用。由圖4可知，酶解產(chǎn)物的抑菌率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到5h時(shí)，抑菌率和水解度均達(dá)到最大，到6h時(shí)，有所下降，可能由于過長(zhǎng)時(shí)間水解造成酶自身分解，水解度降低后導(dǎo)致水解產(chǎn)物抑菌率的降低。

2.3 酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)顯示：一次項(xiàng)A、B的P值均小于0.05，達(dá)到顯著水平；一次項(xiàng)C的P值小于0.01，達(dá)到極顯著水平，說明酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間3個(gè)因素均對(duì)酶解液的抑菌效果具有顯著影響。A2、B2、C2項(xiàng)P值均小于0.01，說明這3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值具有極顯著的二次效應(yīng)，它們與抑菌率之間的關(guān)系符合曲線規(guī)律。交互項(xiàng)AB項(xiàng)P值小于0.01，表明溫度與加酶量交互作用極顯著；AC項(xiàng)P值小于0.05，表明溫度與酶解時(shí)間的交互作用顯著。由P值可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)影響酶解液抑菌效果的因素依次為：酶解溫度<加酶量<酶解時(shí)間。

2.3.2 響應(yīng)面分析

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design Expert8.0軟件分析，血紅蛋白通過胰蛋白酶酶解所得酶解液抑菌效果最好的工藝條件為：酶解溫度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解時(shí)間5.19h，此時(shí)所得酶解液的抑菌率為89.70%。為了檢驗(yàn)該方法所得結(jié)果的可靠程度，在上述最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行豬血紅蛋白酶解反應(yīng)，所得酶解液經(jīng)脫色冷凍干燥后檢測(cè)其抑菌效果，得到的抑菌率實(shí)際值平均為90.32%，相對(duì)誤差為0.691%，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)豬血紅蛋白抗菌肽的實(shí)際制備情況。

3 結(jié) 論

利用7種酶水解豬血紅蛋白發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶酶為制備抗菌肽的最佳用酶。通過單因素試驗(yàn)確定了抗菌肽制備過程中酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間的最適范圍。在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken模型響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法進(jìn)一步優(yōu)化胰蛋白酶酶解豬血紅蛋白制備抗菌肽的工藝條件。通過Design Expert8.0軟件分析得其最優(yōu)條件為：酶解溫度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解時(shí)間5.19h，對(duì)響應(yīng)面的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，酶解產(chǎn)物的抑菌率平均值為90.32%。本實(shí)驗(yàn)以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為指標(biāo)，探討了響應(yīng)面法優(yōu)化胰蛋白酶水解豬血紅蛋白制備抗菌肽的工藝條件，為酶解液中抗菌肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，可進(jìn)一步選取其他常見的指示菌表征酶解產(chǎn)物的抑菌效率。

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