基于生物素-親和素放大的SPR傳感器檢測大腸桿菌研究*

劉儒平，王 程，徐萬幫，岳 釗，牛文成，劉國華*

(1.南開大學信息技術科學學院，天津300071;2.廣東省食品藥品檢驗所，廣州510180)

食品是人類賴以生存和發展的物質基礎，食品安全已經成為世界各國關注的焦點之一，各國都采取最先進的技術和方法開展快速檢測研究來適應新形勢下的需求［1-2］。在衛生質量的評價和控制中，通常采用大腸桿菌作為指示菌，通過對指示菌的檢測和控制來了解水體或食品等受污染狀況，從而保證衛生安全［3］。水和食品中細菌檢測，特別是致病性細菌的檢測，對于控制傳染病、保護環境衛生和人民群眾身體健康有著重要的意義［4-6］。因此，建立特異性強、靈敏度高、快速檢測大腸桿菌的新方法成為環境監測和食品衛生領域專家面臨的嚴峻挑戰。

目前，對大腸桿菌的檢測方法主要有傳統的平板計數法，直接免疫熒光(IFA)法以及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。平板計數法，操作復雜，耗時長(24 h～48 h)，不適合快速檢測［7-9］。直接免疫熒光法(IFA)將熒光素標記在相應的抗體上，與抗原進行反應，具有時間短的優點，但該法無法檢測出假陰性樣品［10］。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)可對大腸桿菌進行快速準確定量，陰性結果無需其他方法加以證實，而陽性結果則需用培養法確認［11］。

表面等離子體共振(SPR)生物傳感技術是一種新興的檢測技術［12-13］。這種傳感器是一種光學傳感器。SPR是一種物理光學現象，其檢測基本原理是當芯片表面的物質或者物質量發生變化時，折射率發生變化，表現為共振角的偏移［14］，一般采用折射率 RIU(Refractive Index Unit)或響應單位 RU(Resonance Units)來表征。SPR生物傳感器具有可在線檢測、可再生、無需樣品前處理等優點，近年來已成為研究熱點［15-16］。但其缺點是在芯片表面固定小分子量或低濃度待測物時不能引起大的信號改變，故檢測靈敏度較低。

本研究針對大腸桿菌快速、靈敏、特異性檢測的需求，以低濃度大腸桿菌ATCC25922檢測為切入點，利用一抗和二抗的質量擴增效應和生物素-親和素的多級放大效應，使用BIACORE 3000 SPR生物傳感器系統，開展了大腸桿菌檢測的光學生物傳感技術研究，實現了大腸桿菌ATCC25922的快速在線檢測，該方法在環境監測和食品衛生領域具有廣泛的應用前景.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

BIACORE 3000 SPR生物傳感器(瑞典BIACORE AB公司)。

單克隆兔抗大腸桿菌ATCC25922血清購于中國獸藥監察所，由北京博奧森生物技術有限公司純化制得兔抗大腸桿菌ATCC25922單克隆抗體;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)購自美國Sigma公司;CM5芯片和鹽酸乙醇胺購自瑞士BIACORE AB公司;鏈霉親和素、生物素標記的羊抗兔IgG抗體(效價1:500)和磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)購自北京欣經科生物公司;鏈霉親和素包被的CdSe/ZnS核殼結構量子點購于武漢珈源公司，采用Tris緩沖液(10 mmol/L Tris，0.1%BSA，0.05%Tween-20，pH 7.4)進行稀釋;實驗用水均為超純水(Millipore Milli-Q超純水系統)，其他無機試劑均為分析純購于美國Sigma公司。

1.2 SPR生物傳感芯片制備

實驗過程如圖1所示，首先注入80 μL新鮮配制的體積比1∶1的50 mmol/L的NHS和200 mmol/L的EDC混合溶液活化芯片。采用去離子水洗凈芯片表面后將70 μL鏈酶親和素溶液(濃度為200 μg/mL，用pH 4.8的醋酸緩沖液配制))注入芯片，靜置10 min。將親和素偶聯于芯片表面。通入30 μL去離子水清洗芯片。注入100 μL濃度為1 mol/L的封閉劑A(鹽酸乙醇胺溶液，pH 8.5)靜置10 min，封閉沒有和親和素反應的活化基團。注入80 μL濃度為200 μg/mL生物素標記的羊抗兔IgG抗體PBS溶液(pH=7.4)，靜置5 min。利用生物素和鏈霉親和素之間的高親和力將生物素標記的羊抗兔IgG固定在芯片上。芯片洗滌后注入80 μL封閉液B(0.05%Proclin300與10%酪蛋白的Tris-HCl緩沖液)且靜置10 min對未反應親和素位點進行封閉，然后用PBS緩沖液清洗。注入80 μL濃度為250 μg/mL的兔抗大腸桿菌ATCC25922單克隆抗體IgG制備成大腸桿菌ATCC25922特異性免疫傳感芯片，對大腸桿菌ATCC25922進行特異性檢測。

圖1 基于生物素-親和素放大的SPR傳感器檢測大腸桿菌ATCC25922示意圖

1.3 樣品檢測與芯片再生

進樣檢測時，待測液體積為80 μL，整個實驗樣液流速為10 μL/min，先通入PBS緩沖液，穩定后通入大腸桿菌ATCC25922菌液，測量結果為兩者樣本響應均值(8個點響應的平均值)的差值。為了提高芯片的使用率，對檢測菌液后的芯片用NaOH溶液進行再生。注入 NaOH溶液流速為20 μL/min，進行抗原抗體的解離。

2 結果與討論

2.1 大腸桿菌與兩種抗體分步偶聯的效果

為了形象地證實大腸桿菌ATCC25922與一抗(兔抗大腸桿菌ATCC25922單克隆抗體)以及二抗(羊抗兔IgG抗體)三者偶聯效果，本實驗選用武漢珈源公司提供的表面偶聯有親和素的CdSe量子點作為標記物進行觀察，將3 μL生物素標記的羊抗兔IgG抗體(1∶500稀釋)溶液與3 μL濃度為2 nmol/L的表面包被親和素的CdSe量子點溶液進行反應，37℃孵育箱中孵育10 min，使生物素標記的二抗(羊抗兔IgG抗體)高效的偶聯在量子點表面。在其他條件不變的情況下，滴5 μL待測大腸桿菌ATCC25922菌液于潔凈載玻片表面，使其盡可能形成單分子薄膜，將該載玻片在空氣中自然干燥2 min，采用去離子水清洗3次。然后于菌液所在區域滴加2 μL濃度為250 μg/mL的一抗溶液，用蓋玻片推平，37℃下保濕盒中孵育10 min，使得大腸桿菌ATCC25922和一抗高效偶聯;然后將上述含有二抗與量子點偶聯物的溶液滴加在連有大腸桿菌ATCC25922的一抗表面，并盡可能平鋪在載玻片上，37℃孵育箱中孵育5 min使其充分結合，加入200 μL的PBST緩沖液沖洗3次，去掉多余量子點標記二抗，將該載玻片置于熒光顯微鏡下觀察。明場觀察如圖2(A);在暗場下，打開紫外激發光源進行觀察，如圖2(B)。量子點在紫外光激發下發出波長為550 nm的綠光，暗場下大腸桿菌約2 μm的橢圓形光點，明場下大腸桿菌與暗場下的光點一一對應，可見大腸桿菌ATCC25922、一抗與二抗三者偶聯效果良好，因此通過二抗(抗抗體)的放大效應，捕獲大腸桿菌是可行的，且偶聯過程未對抗體活性造成較大影響［17］。

圖2 大腸桿菌熒光顯微鏡觀測圖

2.2 大腸桿菌ATCC25922響應曲線測定

將濃度為1.5×108CFU/mL大腸桿菌ATCC25922菌液用PBS緩沖液梯度稀釋為1.5×107CFU/mL、1.5 ×106CFU/mL、1.5 ×105CFU/mL、1.5 ×104CFU/mL、1.5 ×103CFU/mL 和1.5 ×102CFU/mL，利用制備的傳感芯片進行測定，6種濃度菌液的測量結果如圖3所示。樣品檢測時，不含大腸桿菌ATCC25922的PBS緩沖液對照組在進樣過程中RU值較平穩。以PBS緩沖液為測量基準，傳感器響應的平均標準差為21 RU，因此測量大腸桿菌ATCC25922時，大于PBS響應標準差的3倍，即大于63 RU為可信測量值。由圖3可知，不同濃度的菌液達到動態平衡后能夠明顯區分，且濃度越大，RU響應值越大。大腸桿菌ATCC25922菌液濃度為1.5×102CFU/mL響應平均值為83 RU左右，大于63 RU。因此，該傳感器的最低檢出限為1.5×102CFU/mL。

圖3 不同濃度的大腸桿菌ATCC25922溶液的動態響應

2.3 大腸桿菌ATCC25922標準曲線測定

依據檢測體系中菌液濃度越大，RU響應值越大的原理，采用研制的傳感芯片分別對濃度為1.5 ×102CFU/mL、1.5 × 103CFU/mL、1.5 × 104CFU/mL、1.5 ×105CFU/mL、1.5 ×106CFU/mL 和1.5×107CFU/mL的菌液進行測定。結果表明，大腸桿菌 ATCC25922濃度在 1.5×102CFU/mL～1.5×107CFU/mL范圍內與相對響應具有良好的線性關系。其線性方程為ΔRU=23.688Ln(CFU/mL)-66.881，相關系數R為0.981 5。該傳感器檢測時間小于35 min，具有檢測速度快和靈敏度高的特點。本研究靈敏度的提高是由于將生物素標記的二抗(羊抗兔IgG抗體)固定在芯片表面，采用二抗與一抗(兔抗大腸桿菌單克隆抗體IgG)結合，這樣使得SPR傳感器檢測的偶聯物質量增大，反應信號增強，提高了檢測靈敏度。此外生物素-親和素體系具有多級放大作用，每個親和素分子有四個生物素結合位點［18］，可同時以多價形式結合生物素化的抗體。因此，極大地提高了檢測靈敏度。

2.4 干擾實驗

采用研制的基于生物素-親和素放大的SPR傳感芯片檢測大腸桿菌ATCC25922，以肺炎克雷伯菌ATCC13883、金黃葡萄球菌ATCC25923和陰溝腸桿菌ATCC700323分別代替大腸桿菌ATCC25922作為待測物，利用所研制的SPR生物傳感芯片進行測定，驗證本研究方法對大腸桿菌ATCC25922檢測的特異性，結果見表1。干擾菌濃度為104CFU/mL～105CFU/mL時，SPR測量值與空白檢測值接近，相對響應RU遠低于同量級大腸桿菌ATCC25922濃度的檢測值，未發現與金黃葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC13883和陰溝腸桿菌ATCC700323有交叉反應，說明該方法對大腸桿菌ATCC25922具有特異性。

表1 特異性檢測實驗結果

2.5 大腸桿菌ATCC25922檢測重復性實驗

采用所研制的大腸桿菌SPR傳感芯片對濃度為1.5×105CFU/mL的大腸桿菌ATCC25922進行測試，連續檢測5次進行重復性實驗，實驗結果見表2。檢測結果的相對標準偏差為4.80%，具有較好的重復性。

表2 細菌檢測儀重復性測試結果

2.6 本研究與傳統培養計數法相關性分析

采用研制的SPR傳感芯片對6個濃度梯度的大腸桿菌ATCC25922樣品進行檢測與傳統培養計數法進行對比測試，大腸桿菌ATCC25922濃度范圍:1.5 ×102CFU/mL ～1.5×107CFU/mL，每個樣品平行測量3次。首先根據不同濃度的大腸桿菌與相對響應(RU)之間的標準曲線，將所測樣品的相對響應換算成濃度。將本方法測試的濃度與平板計數結果測試的濃度(菌落數除以菌液體積)進行對比，兩者經相關性分析后的對比結果如圖4。結果顯示，基于生物素-親和素放大的SPR傳感器快速檢測大腸桿菌ATCC25922與傳統培養計數法具有良好的相關性，相關系數R=0.986 9(P＜0.05)。

圖4 本方法與平板計數法對大腸桿菌ATCC25922樣品濃度測試的對比

3 結論

本研究選用Biacore 3000系統及CM5芯片，通過生物素-親和素放大效應和一抗-二抗的質量擴增效應提高了SPR檢測大腸桿菌ATCC25922的靈敏度，成功建立了一種寬動態范圍定量檢測大腸桿菌ATCC25922的SPR的方法，較現有方法避免了復雜的操作過程。實現了大腸桿菌的低濃度檢測，檢測下限為1.5×102CFU/mL，檢測時間約為35 min。該法與平板計數法對大腸桿菌測試具有良好的相關性。本研究具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優點，尤其在食品細菌特異性檢測中體現出明顯的優越性，該技術在食品安全分析、環境污染檢驗等方面具有廣闊的應用前景。

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