基于Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料固定化酶的葡萄糖生物傳感器*

馬莉萍，左顯維，王艷鳳，李云霞，張 彪，韓根亮

(甘肅省科學院傳感技術研究所，蘭州730000)

葡萄糖生物傳感器在臨床檢驗、發酵控制及食品分析等方面發揮著重要的作用，目前絕大多數葡萄糖生物傳感器均采用在電極表面修飾葡萄糖氧化酶(GOD)的方法來制備。但是，GOD的氧化還原活性中心位于分子中心，使酶與電極間電子傳遞很難實現。近年來，將納米材料引入生物傳感器以提高生物酶與基體電極之間的電子傳導能力成為研究熱點，眾多的納米材料如:Au［1－2］、Ag［3］、Pt［4］等貴重金屬以及碳納米管［5］、導電聚合物薄膜［6］等均已被成功地用于固定生物酶。最近又有研究發現新型的稀土元素納米氧化物CeO2有助于電子在電極表面的傳遞［7－8］，從而使其成為在生物傳感器領域極具應用前景的一類材料。

一些研究表明，采用納米材料復合物［9－11］固定生物酶時，組成復合物的各種單元組分在納米尺度上復合，能產生較強的協同效應，同時又具有納米粒子的特性。其中，無機納米材料與有機高分子材料形成的復合物由于集納米粒子與功能性高分子的特性于一身，在生物傳感器中極具應用前景。在眾多有機高分子材料中，聚苯胺因合成條件簡單，具有優良的導電性，已成為研究熱點［12－14］。將導電聚苯胺與無機納米材料復合，所形成的復合材料不僅具有優良的電化學性能，而且可以使導電聚苯胺在中性環境下有效的進行氧化還原反應，拓展其在生物傳感器領域的應用［15－17］。

故本文合成了基于金納米粒子、氧化鈰納米顆粒和導電聚苯胺的納米復合材料(Au NPs-CeO2@PANI)，以其固定GOD，實現對葡萄糖濃度的測定。研究表明，本文合成的Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料同時兼具了三種單一材料各自的優點，該納米材料實現了酶與電極間的直接電子轉移，有效地提高了傳感器的電流響應、靈敏度和使用壽命，在葡萄糖電化學生物傳感器中具有較好的應用前景。

1 實驗部分

1.1 試劑

苯胺(An):分析純(使用前減壓蒸餾);硝酸鈰(Ce(NO3)3·6H2O)，氯金酸(HAuC14)，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O)，過硫酸銨 ((NH4)2S2O8，APS)，鹽酸(HCl)，硝酸(HNO3)，乙醇(C2H6O)均為化學純;以上試劑均購于上海化學試劑廠。葡萄糖氧化酶(GOD)，殼聚糖(Chit，脫乙酰度85%)，均購于美國Sigma公司。

1.2 儀器

復合材料表征:JEM－100SX型電子透射顯微鏡(日本電子公司);D/MAX－3C型X射線衍射儀(日本Rigaku公司);FTS3000FX型的傅立葉變換紅外光譜儀(美國DIGILAB公司)，KBr壓片;PE-PYRIS Diamond TG/DTA熱重分析儀。

電化學實驗:AUTOLAB PGSTAT 128N模塊式電化學綜合測試系統(瑞士萬通公司)，電化學測量采用三電極體系:酶電極為工作電極，鉑片電極作輔助電極，飽和甘汞(SCE)電極為參比電極。所有電化學實驗均在室溫下進行。

1.3 Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料的合成

參照已報道的文獻［18－19］，首先制備出氧化鈰納米顆粒和金溶膠。然后，按以下步驟合成Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料:①將一定量的CeO2納米顆粒超聲分散在20 mL 1 mol/L HCl溶液中，再加入1 mL苯胺單體，超聲分散30 min，形成懸浮液 A;②將2.49 g(NH4)2S2O8溶解在 5 mL 1 mol/L鹽酸溶液中，形成溶液B。③用滴液漏斗將B緩慢滴加到A中，在磁力攪拌下反應12 h。反應結束后離心分離，分別用0.1 mol/L鹽酸溶液、乙醇和二次水洗滌產物至離心液為無色，60℃真空干燥24 h，得到CeO2@PANI納米復合材料。④將經①②③步所得的具有核－殼結構的CeO2@PANI納米復合材料在濃度為1.0 mg/mL金溶膠中攪拌12 h后，離心分離，并將產物真空干燥，既得Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料。

采用上述類似方法制備了摻雜態PANI、CeO2@PANI納米復合材料及Au NPs-PANI納米復合材料。

1.4 Chit/Au NPs-CeO2@PANI/GOD 修飾電極的制備

直徑為2 mm的鉑盤電極用0.3及0.5 μm的Al2O3拋光粉打磨，依次用去離子水、無水乙醇及丙酮超聲清洗3 min。然后在0.5%H2SO4中進行電化學預處理，以增加電極表面電活性點的濃度，將電極在－0.4 V～+1.0 V下以50 mV/s掃速循環伏安掃描30圈至穩定。

將制備好的Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料在去離子水中超聲分散2 h，使溶液濃度為1.0 mg/mL;取 Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料、1 mg/μL葡萄糖氧化酶及質量分數為1.0%殼聚糖，按體積比為3∶3∶1充分混勻后滴于電極表面，4℃放置晾干，作為工作電極。對照組各修飾電極的制備同上。

1.5 測量方法

電化學測量采用三電極系統:鉑盤電極(直徑3 mm)為工作電極，飽和甘汞(SEC)電極為參比電極，鉑片為對電極;以0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)為支持電解質，室溫條件下，加入不同濃度葡萄糖，在0.8 V～0.2 V范圍內進行循環伏安掃描，記錄循環伏安掃描曲線。電流時間曲線測定時，工作電位為－0.55 V(vs.SCE)，攪拌時測定。測試時體系通N2除O2。

2 結果與討論

2.1Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料的結構表征

圖1(a)為Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料的透射電鏡(TEM)圖，從圖中可看出顏色較深的無機物CeO2納米顆粒被完全包埋在顏色較淺的無定形的有機物聚苯胺中，形成了核－殼結構;殼層聚苯胺的厚度大約有25 nm，而被包埋的CeO2核平均粒徑在10 nm左右。TEM圖中像蓖麻一樣的小黑點為金納米顆粒，這些金納米顆粒均被牢牢地吸附在聚苯胺的表面。在圖中沒有觀察到有機相與無機相兩相的分離現象，這說明無機物CeO2、Au與有機物 PANI之間很好的復合在了一起。

圖1 Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料的TEM圖(a)和XRD譜圖(b)

圖1(b)為Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料X射線衍射譜(XRD)，在 2θ=15.48°、20.30°和 25.10°處出現了寬的衍射峰為結晶態聚苯胺的特征衍射峰［14］;在 2θ=28.4°，32.3°，46.7°，55.9°，58.1°和67.5°處出現的衍射峰與立方晶系CeO2的標準譜圖(JCPDS卡號 No.34－0394)一致;而另外在 2θ=37.1°，44.2°，63.4°，和 77.8°的四處衍射峰與立方晶系Au的標準譜圖(JCPDS卡號No.01－1172)一致，這表明該樣品是由聚苯胺、CeO2和組成Au的。根據Scherrer公式 D=k(/βcosθ(k 取 0.89，(為 0.154 nm)，由2θ=28.4°處半峰寬計算出樣品中 CeO2粒子的粒徑為10.5 nm，這與TEM結果基本一致。

2.2 修飾電極的電化學特性

圖2為不同修飾電極在0.2 mol/L PBS(pH=7.0)中的循環伏安掃描圖掃速為50 mV/s。由圖中可看出，GOD修飾的電極沒有氧化還原峰(圖2(a))，表明酶與電極間的電子轉移無法實現;Chit/CeO2-PANI/GOD及Chit/Au-PANI/GOD修飾的電極氧化還原峰不明顯(圖2(b)、(c))，表明這些材料修飾的電極表面酶與電極間的電子轉移較難實現;而Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極出現了較為對稱的氧化還原峰(圖2(d))，峰電勢分別為在0.55和0.03，說明該修飾電極使酶與電極間的電子轉移容易實現，并且葡萄糖氧化酶在電極上保持了良好的生物活性。

Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料在中性條件下有良好的氧化還原活性，且有效的實現了酶與電極之間的直接電子轉移，主要是因為:①CeO2具有較高的等電點(IEP)(9.0)，它適合吸附具有低IEP(4.2)的GOD，對帶負電性的GOD提供友好的微環境，能在很大程度上促進GOD和電極之間的電子傳遞;②PANI能很好的催化GOD，同時，納米結構的PANI負載酶時，其巨大的比表面積增加了載酶量;③納米Au的優良導電性能。本文合成的Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料同時兼具了三種單一材料各自的優點，而且復合材料比單一納米顆粒更易于形成連續勢場，可降低電子在電極和固定化酶間的遷移阻力，能有效加速GOD的再生過程，顯著增強了傳感器的電流響應。

圖2 不同修飾電極在0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中的循環伏安掃描圖，掃速為50 mV/s

圖3為Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極在10 mmol/L葡萄糖溶液中不同掃速下的循環伏安圖，從圖中可看到，隨著掃速從10 mV/s增加到100 mV/s，GOD氧化還原峰電流隨掃描速率的增加而增大，這是因為隨著掃描速度加快，單位時間通過電極表面的電子增多使電流變大;而圖3中峰電勢差為0.52 V，峰電勢差不隨掃速的變化而變化，表明電極反應是準可逆過程。插圖為峰電流與掃速的平方根的關系圖，經計算陽極和陰極的峰電流Ip與掃描速率的平方根成線性關系(見圖3插圖)，表明修飾電極上的電化學反應主要是受擴散控制。此外，在連續的掃描過程中C－V圖基本保持不變，說明GOD的活性在Chit/Au-CeO2-PANI復合膜中是穩定的。

圖3 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極在不同掃速下的循環伏安圖(插圖：峰電流與掃速的平方根的關系圖)

2.3 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極對葡萄糖催化的電化學行為

圖4是Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極在PBS(pH=7.0)溶液中及1 mmol/L葡萄糖溶液中的循環伏安曲線比較圖。由圖可知，當加入葡萄糖之后(圖4b)，氧化峰電流明顯增大，顯示了明顯的GOD對葡萄糖的催化氧化能力。

圖4 修飾電極的CV圖

2.4 電流時間曲線及線性檢測

圖5為在0.55 V電位下 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極對葡萄糖的電流響應隨葡萄糖濃度變化的計時安培動力學曲線。由圖可見，氧化峰電流隨著葡萄糖濃度的增加呈臺階式上升，電極電流響應時間為5 s，表明Chit/Au-CeO2-PANI復合膜吸附固定的GOD對葡萄糖具有優良的催化氧化能力，可在電極表面迅速建立氧化還原平衡反應。在6.2×10－6mol/L ～2.8×10－3mol/L 范圍內，電極電流響應與葡萄糖濃度呈線性關系(圖5插圖)，檢測下限為1.0×10－6mol/L，線性方程:I(μA)=0.118+5.065 C(mmol/L)，相關系數為0.996 8。隨著葡萄糖濃度的進一步增加，電流到達平臺期，遵從Michaelis-Menten kinetics動力學方程的特性。

圖5 傳感器對葡萄糖響應的電流－時間曲線(插圖：電極電流響應與葡萄糖濃度的線性關系圖)

相同條件下，Au修飾電極檢測葡萄糖線性線性范圍為 4.0×10－5mol/L ～1.0×10－3mol/L，響應時間10 s;CeO2-PANI修飾電極檢測葡萄糖線性線性范圍為 9.0×10－4mol/L ～ 1.0×10－2mol/L，響應時間15 s，Au-PANI檢測葡萄糖線性線性范圍為1.0×10－5mol/L ～ 1.0×10－3mol/L，響應時間 8 s。說明Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料修飾的電極顯示出了比單一或二者復合的納米材料修飾電極更優越的性能。

2.5 傳感器的穩定性檢測

圖6為Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極的穩定性檢測。電極不用時保存于4℃。該電極在保存5天后，酶活下降約4%，三周后，電極對葡萄糖的響應仍能保持原來的80%(如圖6所示)，可見該傳感器有較好的穩定性。表明Chit/Au-CeO2-PANI復合膜能很好地固定GOD，使用納米材料能最大限度的保持酶的活力。

圖6 傳感器的穩定性檢測

3 結論

本文首先成功合成了Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料，對其進行了表征。然后，將該納米復合材料應用于葡萄糖生物傳感器中，并對傳感器進行了電化學性能測試。研究結果表明，該Au NPs-CeO2@PANI納米復合材料修飾的電極比單一或任意二者復合材料修飾電極具有更好的電催化活性，顯示了優越的性能，如:高靈敏度、低檢測限、高穩定性等，提高了電極與生物酶之間的電子轉移。該生物傳感器檢測葡萄糖的線性范圍為 6.2×10－6mol/L ～ 2.8×10－3mol/L，響應時間為5 s，檢測下限為1.0×10－6mol/L。

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