木芙蓉葉提取物抗病毒作用實驗研究

張 麗，周長征

(山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

木芙蓉葉為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥葉，其味微辛，性涼，歸肺、肝經，具有清肺涼血、散熱解毒、消腫排膿等功效，臨床主要用于肺熱咳嗽、瘰疬等的治療[1]。本實驗通過體外建立細胞感染模型試驗和體內感染小鼠試驗來驗證木芙蓉葉提取物具有抗病毒的藥理活性，以期為木芙蓉葉能開發成一種防治病毒的新藥提供藥效學依據。

1 實驗材料

1.1 藥物 木芙蓉HibiscusmutabilisL.葉購于安徽濠州藥材市場，由周鳳琴教授鑒定。陽性對照藥利巴韋林針劑(100mg/mL，山東魯抗醫藥集團有限公司)。

1.2 病毒 呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)均引自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所。

1.3 細胞 HEK-293細胞(人胚胎腎細胞系)購自美國Clontech公司。

1.4 試劑 MEN培養基(美國Gibco公司)；新生小牛血清(杭州四季青公司)；胰酶(美國Gibco公司)；細胞維持液(含2%新生牛血清的MEN)；細胞培養液(含10%新生小牛血清的MEN)；其他試劑均為分析純。

1.5 儀器 CO2恒溫培養箱(美國Forma公司)；-80 ℃冰箱(美國Forma公司)；-20 ℃冰箱(中國青島得貝公司產品)；酶標儀(芬蘭Labsystems公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；高速離心機(德國Heraeus公司)；旋轉蒸發儀(中國上海鑫培儀器設備有限公司)。

1.6 動物 昆明種鼠，雄性，體質量13～14 g，潔凈級，引自山東大學動物中心。

2 實驗方法

2.1 提取物的制備 木芙蓉葉煎煮3 h，水提液減壓濃縮至稠浸膏，加入乙醇進行醇沉,過濾得到沉淀，沉淀用蒸餾水溶解。用D101型大孔吸附樹脂進行洗脫得到25%乙醇洗脫液,濃縮洗脫液，使其生藥含量為0.5 g/mL，藥液過0.2 μm孔徑濾膜除菌，備用。

2.2 體外抗病毒試驗

2.2.1 藥物細胞毒性測定 將HEK-293細胞懸液接種于96孔板中,使其長成單層細胞。用細胞維持液以2倍比稀釋陽性對照藥品利巴韋林和木芙蓉葉提取物，每孔100 μL，每個稀釋度縱向設立3個復孔，平行方向設2行正常細胞對照。將96孔板置37 ℃,5%CO2培養箱中培養，每日用顯微鏡觀察細胞生長狀態和形態的變化，連續觀察5 d，染色，使用酶標儀在540 nm處測定各孔光吸收值，利用Reed-Mucnch法計算藥物半數中毒濃度(TC50)[2]。

2.2.2 藥物的抑毒作用 將細胞懸液接種于96孔板中，使其長成單層細胞,倒掉培養液，將待測藥液按2倍比稀釋順序橫向接種在各孔中,每孔100 μL藥液，然后接種100TCID50的不同病毒液50 μL，每種病毒橫向接種1行,縱向設置3個復孔，每塊96孔板均設置利巴韋林陽性藥品對照，病毒對照，正常細胞對照以及空白對照(無細胞生長)。置37 ℃，5%CO2培養箱中培養5 d,每日觀察細胞生長狀態和形態，以細胞病變效應(CPE)為指標，以病毒對照出現4級CPE為終點，染色，使用酶標儀在540 nm處測定各孔光吸收值，計算細胞存活率，利用Reed-Mucnch法計算半數有效濃度(EC50),得到治療指數TI=(TC50/EC50)，治療指數越大表示藥物作用越強。細胞病變效應(CPE)劃分級別[3]：0級細胞無病變出現，正常生長；1級細胞出現25%以下的病變；2級細胞出現25%～50%的病變；3級細胞出現50%～75%的病變；4級細胞出現75%以上的病變。

2.3 體內抗病毒試驗

2.3.1 接種病毒劑量的測定 昆明種小鼠40只，將動物按體質量隨機分為4組，每組10只，分別為：病毒大劑量組、病毒中劑量組、病毒小劑量組和正常對照組。各組動物乙醚麻醉[4]下分別鼻腔接種上述RSV毒液(效價320∶1)50、25、12.5 μL和細胞培養液50 μL，常規喂養，每日觀察動物存活情況，記錄死亡動物及時解剖，做病理學檢測。在第7天末次給藥40 min后，將動物眼動脈叢放血，牽頸臼處死，無菌取肺組織，做病理學檢測[5]。

2.3.2 藥物體內抗病毒活性測定 將動物隨機分為正常對照組、病毒模型對照組、利巴韋林對照組和木芙蓉葉提取物大、中、小劑量治療組，每組10只。在乙醚麻醉下，正常組動物鼻腔接種細胞培養液25 μL，其余動物均鼻腔接種RSV毒液25 μL。藥物灌胃，每日2次，連續7 d。每日觀察動物鼻腔是否有分泌物、存活情況，在第7天末次給藥4 h后,將動物稱重后眼動脈叢取血、牽頸臼處死，無菌條件下取肺組織，稱重計算肺指數，得到肺指數抑制率[5]。(肺指數=小鼠肺重/小鼠體質量×100%；肺指數抑制率=(病毒對照組平均肺指數-給藥組平均肺指數)/病毒對照組平均肺指數×100%)

3 實驗結果

3.1 體外抗病毒試驗結果 木芙蓉葉體外抗病毒試驗結果表明木芙蓉葉提取物對3種病毒都有不同程度的抑制作用,其提取物對抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的增殖有較為顯著的作用，治療指數達到了89.08，對甲型流感病毒(Flu A)也有較好的抑制作用，但對副流感病毒(HPIVs)致細胞病變的抑制作用相對較小(見表1)。

表1 木芙蓉葉體外抗病毒試驗結果

3.2 體內抗病毒試驗結果

3.2.1 接種病毒劑量測定的結果 與正常對照組比較，接種病毒組動物毛色暗淡,缺乏光澤。正常對照組動物無死亡；大劑量病毒組動物在造模第6天死亡3只；中、小病毒劑量組動物無死亡。大劑量組肺組織外觀出現明顯充血、出血斑點或花紋等癥狀,有2只動物出現一葉肺萎縮，有3只動物出現一葉肺實變；中劑量病毒組動物肺組織也可見到充血或花紋;小劑量病毒組3只動物肺組織出現斑點。病毒重分離大劑量病毒組有9只、中劑量8只、小劑量2只分離到病毒(見表2)。考慮到本實驗的目的是觀察木芙蓉葉提取物防治上呼吸道感染的效果,所以決定采用25 μL病毒為造模適宜劑量。

表2 接種病毒劑量測定結果

3.2.2 藥物體內抗病毒活性測定結果 通過統計學數據處理,病毒對照組與正常組比較肺指數有顯著差異(P<0.01)，RSV可以引起正常鼠肺指數的升高，表示造模成功；經過藥物灌胃治療后，3組木芙蓉葉提取物給藥組，利巴韋林陽性對照組均能降低由RSV引起的小鼠肺部感染的肺指數，與病毒對照組比較均具有統計學意義(P<0.01,P<0.05)(見表3)。試驗結果說明木芙蓉葉提取物可以抑制由RSV引起的小鼠上呼吸道感染,并且在一定的劑量范圍內，其活性隨劑量的增大而增強。

4 討論

上呼吸道感染是臨床上的常見病，常由呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒等引起。目前治療呼吸道病毒感染的藥物主要有利巴韋林、金剛烷胺、聚肌胞等藥物[6],這些藥物的抗病毒譜相對較窄，而且這些藥物的不良反應較大，所以尋求效果顯著、不良反應小的藥物是目前研發的主要目標，所以中藥成為治療病毒性上呼吸道感染的熱門。[7-8]

表3 木芙蓉葉提取物對RSV感染小鼠肺部炎癥(肺指數)的影響(±s,n=10)

通過體外抗病毒實驗證明，木芙蓉葉提取物對RSV等3種病毒均具有體外抗病毒作用，尤其是對RSV的抑制作用較強;通過體內試驗從肺組織外觀可以觀察到肺組織的病變程度有了明顯的減輕，肺指數降低較為顯著,證明木芙蓉葉提取物在所試劑量范圍內對RSV引起的肺部炎癥有明顯的抑制作用。所以綜合體內、體外實驗的結果可知木芙蓉葉提取物具有較好的抗病毒作用，為治療上呼吸道病毒感染疾病提供了充分的藥理藥效學基礎。

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