浙江清涼峰地衣內(nèi)生菌物種多樣性及活性研究

劉靜，胡玲，王海英，趙遵田

(山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014)

地衣(Iichens)是真菌和藻類的共生復合體，地衣內(nèi)生菌可產(chǎn)生對多種病原菌具抑制活性的次生代謝產(chǎn)物，因此，許多地衣學家期望能通過人工培養(yǎng)手段盡快獲得足夠生物量的地衣內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物，為研究其活性及化學特性提供豐富的原材料。目前，幾乎都是通過Yamamoto法［1］分離地衣內(nèi)生菌，然而該方法污染率非常高，因此，我們采用刮皮層挑取菌絲的新方法以較高效地獲得目標內(nèi)生菌［2］。

對浙江省清涼峰10m×10m樣方采集的地衣體標本進行分離培養(yǎng)，得到的55株地衣內(nèi)生菌進行ITS序列和28S序列的分子鑒定，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索，ClastalX 2.11多重序列比對以及MEGA 5.0最小進化法(ME)構建系統(tǒng)發(fā)育樹［3］，得知該地區(qū)地衣內(nèi)生菌的物種多樣性［4］。

該研究對55株地衣內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物進行活性初篩，利用濾紙片法［5］檢測其次生代謝產(chǎn)物的抗細菌、真菌活性。結果表明，其代謝產(chǎn)物具較強的抗細菌、白色念珠菌的生物活性，具抑菌活性的菌株占所測總菌株的14.55%。地衣內(nèi)生菌產(chǎn)生的各種活性物質(zhì)在生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)發(fā)酵等方面都表現(xiàn)出很好的應用前景［6］，受到世界各國專家的廣泛關注。

1 材料與方法

1.1 材料

從分離培養(yǎng)的82株地衣內(nèi)生菌中選取菌落的形態(tài)、顏色差異較大的55株作為受試菌株。

1.2 方法

對55株受試菌株進行ITS序列和28S序列測定［7］。

1.2.1 地衣內(nèi)生菌的分子鑒定

采用CTAB法［8］提取內(nèi)生菌總DNA，然后進行ITS序列和28S序列的擴增，ITS序列所用引物為E9:5′－TTGTACACACCGCCCGT－3′;CL2R:5′－TTTCTTTTCCTCCGCT TTATTGA－3′，28S 序 列 所 用 引 物 為 L1:5′－ACCCGCTGAACTTAAGCATA－3′;CL6R:5′－TGCTACTACCACCAAGATC－3′。擴增條件［9］為:95℃ 預變性3 min，94℃變性30 s;52℃復性30 s，72℃延伸30 s，共37個循環(huán)，72℃后延伸10min，4℃保存。擴增的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測之后進行測序。

1.2.2 地衣內(nèi)生菌的活性初篩

1.2.2.1 培養(yǎng)基［10－12］

(1)PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、去離子水1000mL、pH值7.0;

(2)LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、去離子水1000mL、pH 值7.4。

1.2.2.2 拮抗實驗菌株

(1)供試細菌:大腸桿菌(Escherichia coli DH5αi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum);

(2)供試真菌:白色念珠菌(Monilia albican)。

1.2.2.3 抗生素

氨芐青霉素(Ampicillin)、鹽酸四環(huán)素(Tetracycline hydrochloride)。

1.2.2.4 內(nèi)生真菌發(fā)酵及代謝產(chǎn)物的提取

分離到的地衣內(nèi)生菌斜面培養(yǎng)物經(jīng)活化后分別接種至200mL PDA發(fā)酵培養(yǎng)基中，22℃搖床上以110 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)21 d，發(fā)酵結束后將發(fā)酵物用乙醇超聲30min后浸泡抽提1 d，旋蒸后的浸膏用乙酸乙酯萃取1 d，用2 mL甲醇將旋蒸干后的粗提物0.5 g溶解，配成0.25 g/mL的濃縮液［13］。

1.2.2.5 內(nèi)生真菌代謝物抗細菌、抗真菌活性檢測

采用濾紙片法進行抗菌活性檢測:活化后的細菌培養(yǎng)液用無菌水稀釋成105 cfu/mL的菌懸液［14］，取0.1mL菌懸液涂布于LB平板上。將無菌小濾紙片(直徑為6 mm，高溫蒸汽殺菌后烘干)浸泡在濃度為10mg/mL粗提液中約30min，瀝干貼于含菌平板上，以浸有0.1 mg/mL氨芐青霉素的濾紙片為陽性對照，以浸有甲醇的濾紙片為陰性對照，37℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小及有無。吸取200 μL白色念珠菌的稀釋液(105cfu/mL)涂布于PDA平板上，28℃培養(yǎng)48 h，其余均與細菌相同，并用空白濾紙片吸取甲醇溶液作為陰性對照;用浸泡過鹽酸四環(huán)素的濾紙片晾干后貼于平板上作為陽性對照，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，設置3個重復。

2 結果

2.1 菌株的分類學地位

對獲得的ITS序列和28S序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索，ClastalX 2.11多重序列比對以及MEGA 5.0最小進化法(ME)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到所有菌株的分類學地位如下:3個綱:即 Dothideomycetes、Tremellomycetes、Elaphocordyceps;6 個目:Pleosporales、Hypocreales、Chaetothyriales 、Myriangiales、Dothideales、Capnodiales;10 個 科:Nectriaceae、Herpotrichiellaceae、Teratosphaeriaceae、Massarinaceae、Pleosporaceae、Capnodiaceae、Montagnulaceae、Bionectriaceae、Xylariaceae、Dothideomycetes。

2.2 菌株次生代謝產(chǎn)物的抗菌活性

受試菌株中有4株抗白色念珠菌的活性很強，抑菌圈的最大直徑達到3.0 cm，另外還有5株具較好的抗細菌活性，抑菌圈直徑達到2.0 cm左右，菌株4734a的抗細菌和白色念珠菌活性都較強(見圖1)。所有菌株對金黃色葡萄球菌均無明顯抑制作用，抑菌活性較好的菌株數(shù)共8株，占總菌株的14.55%。8株地衣內(nèi)生菌的抑菌活性照片見圖1～3，抑菌效果見表1。

表1 8株地衣內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effect of secondary metabolites of eight endolichenic fungi

3 討論

通過GenBank的相似性搜索和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了浙江省清涼峰該實驗樣方內(nèi)地衣內(nèi)生菌均屬于子囊菌門。Hartmann等［15］的研究表明，利用多樣性指數(shù)分析復雜微生物群落結構是非常有利的。本文采用Shannon－Weiner指數(shù) (H′)=來描述地衣內(nèi)生菌的物種多樣性，得出該樣方總的內(nèi)生菌群落生物多樣性指數(shù)為1.44，均勻度為0.25。數(shù)據(jù)分析顯示，該實驗樣方內(nèi)的地衣內(nèi)生菌群落顯示出了較豐富的生物多樣性(1.44)，且通過GenBank的相似性搜索得知該內(nèi)生菌菌群多為未知菌群，充分地顯示了該地衣內(nèi)生菌是一個非常獨特的微生物新類群，對該地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的群落研究具有一定的價值和意義。

抗菌活性研究結果顯示，該樣方內(nèi)地衣內(nèi)生菌的抗菌活性菌株占總菌株數(shù)的14.55%，且抗菌活性較強。本實驗只是初步定性地研究了清涼峰的地衣內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的抗細菌、真菌活性，對其抗菌活性的定量研究需要做進一步的分析，同時也應該研究其抵抗植物病原菌、抗腫瘤、抗病毒以及抗氧化能力，并通過化學的方法將活性較強的單體化合物分離提取出來［16］?？傊?，作為一種新型的植物研究資源，地衣內(nèi)生菌的深入研究對新藥的開發(fā)具有潛在的應用價值，為人們尋找各種具有較強生物活性的先導化合物開辟了新途徑，從而可以使某些珍稀但瀕臨滅絕的高等藥用植物得到進一步的保護。

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