煙草疫霉拮抗菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究

叢 銘，施渺筱，張傳萍，葛永怡，陳 雪，李 祝*

（1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.安順學院，貴州 安順 561000；3.畢節(jié)市煙草公司，貴州 畢節(jié) 551700）

煙草疫霉病Phytophthora parasiticavar nicotianae（Breda de Hean）Tuker是我國煙草生產危害嚴重的病害之一，除東北煙區(qū)零星發(fā)生以外，包括臺灣省在內的華南、華中、華東和西北種植煙區(qū)均廣泛發(fā)生，經(jīng)濟損失較為嚴重。

目前生產上一般采用抗病品種、栽培防治以及化學防治的綜合防治措施，但由于該病菌的游動孢子形成速度快且數(shù)量大，侵染煙株后潛育期短、發(fā)病快，在一個生長季節(jié)可以發(fā)生多次再侵染，同時該病有時還與其他病害混合發(fā)生，從而導致一些抗黑脛病品種抗性的喪失；化學防治中化學農藥的采用，短期內有效，但長期反復施用，會造成煙株藥害、煙株農藥殘留和病菌對農藥的抗藥性[1]。從現(xiàn)有植物病害生物防治的研究報道來看，采用的微生物種類有細菌、真菌、病毒等微生物，其中細菌種類較多[2]，特別是芽孢桿菌因其具有較強的抗逆性、容易保存顯示出巨大的生防潛力和前景。

生物防治是國際上目前進行植物病害防治的首選防治措施，這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有高效、無毒、無殘留和低成本等特點[3]，所以，生物防治策略的優(yōu)點和重要性就逐漸凸顯出來，越來越受到煙草界人士的關注。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌

菌株來源：采自貴州省畢節(jié)8個縣市種植煙草的田地土壤樣品122份，貴州大學生命科學學院真菌資源研究室分離、篩選、保存。

供試指示菌：本實驗采用煙草黑脛病菌病原菌煙草疫霉（Phytophthora parasitica）作為病原指示菌，貴州大學微生物實驗室分離、篩選、鑒定、保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH7.2。

燕麥培養(yǎng)基[4]：燕麥30g，瓊脂20g，pH值自然（燕麥片30g，加入1000mL蒸餾水，100℃水浴約1h，8層紗布過濾去渣，再加蒸餾水補足1000mL）。

10% V8培養(yǎng)基[5]：10mL V8果汁加去離子水90mL，CaCO30.02g，瓊脂2g，用于培養(yǎng)待接種疫霉菌絲塊，121℃滅菌20min。

NYBD培養(yǎng)基[6]：牛肉浸膏8.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1000mL。

1.2 儀器與設備

AIRTECH超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；BS224S電子天平：Sartorius 公司；DELTA320 pH 計：梅特勒-托利多公司；LDZX-50KBS立式壓力滅菌鍋：上海申安醫(yī)療機械廠；Sky2102C控溫搖床：Sukun 公司；YSEI電熱鼓風干燥箱：永生儀器公司；EPS 100電泳儀：Tanon 公司；DRP-9002生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；TDL-500B離心機：上海安亭科學儀器廠；SHZ-82A數(shù)顯恒溫振蕩器：金壇市富華儀器有限公司；QHZ-98B振蕩培養(yǎng)箱：太倉華美生化儀器廠；759紫外可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；RH Basic磁力攪拌器：廣州IKA 公司；S1000PCR儀：Eppendorf 基因有限公司。

1.3 篩選方法

1.3.1 菌株的分離

平板稀釋涂布法[7]：稱取10g風干的土樣放于盛有90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，置于160r/min的搖床上振蕩30min，靜置5min，吸取1mL懸浮液置于裝有9mL無菌水的試管中，混勻后逐級梯度稀釋，取10-4、10-5和10-63個梯度的懸浮液0.1mL于倒好冷卻的牛肉膏蛋白胨平板表面，每個梯度3個平行，涂布，于37℃培養(yǎng)48h。挑取菌落形態(tài)不一樣的單菌落在斜面上劃線保種，培養(yǎng)24h，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 平板對峙法篩選拮抗細菌

初篩：用直徑0.5cm的打孔器將煙草疫霉菌絲塊接種于燕麥培養(yǎng)基平板中心，在距平板中央2.5cm十字交叉處等距離接種不同的分離菌，以不接種分離菌為對照，每處理3次重復。28℃培養(yǎng)，對照長滿全皿時，記錄抑菌圈大小[8]。

復篩：將純化的菌體篩選有抑菌效果菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，160r/min、28℃培養(yǎng)48h。采用發(fā)酵液濾紙片擴散法，對初篩拮抗效果明顯的煙草黑脛病菌拮抗菌菌株進行復篩，每個初選菌株做3個平行，方法同初篩。28℃培養(yǎng)，對照長滿全皿時，觀察并記錄。挑取抑菌圈周圍的煙草疫霉菌絲制片，顯微觀察。

1.4 拮抗細菌的鑒定

形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化特征：用平板劃線法將菌種接種于平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，按常規(guī)方法觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、光澤、質地、透明程度和菌落及培養(yǎng)基顏色等），進行革蘭氏染色，芽孢染色。

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]、《伯杰細菌鑒定手冊》（第九版）[10]和《芽孢桿菌屬》[11]對菌株講行生理生化鑒定。接觸酶、糖發(fā)酵實驗、V-P實驗、淀粉水解實驗、檸檬酸鹽利用實驗、耐鹽性和需鹽性實驗、pH5.7生長實驗、牛奶分解、硝酸鹽還原、吲哚實驗和明膠液化實驗。

16S rDNA 序列分析：采用上海生工Ezup柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細菌）提取。

PCR 反應體系（25μL）為DreamTaqTMGreen PCR Master Mix（2×）：12.5μL；上游引物：2μL；下游引物：2μL；ddH2O：6.5μL；模板DNA：2μL；總體積：25μL。

PCR反應條件為94℃、3min；94℃、45s，54℃、30s，72℃、1min，25個循環(huán)；72℃終延伸5min，4℃保存[4]。

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將所得序列通過NCBI—BLAST 進行序列比對分析

1.5 拮抗菌株液體發(fā)酵條件優(yōu)化

本實驗對其液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，即對菌株1205的培養(yǎng)時間、裝液量、培養(yǎng)溫度、起始pH值、搖床轉速、接種量進行研究。以摸索最佳培養(yǎng)條件和相關技術要素，進一步提高其發(fā)酵濾液中活性成分的含量，為工業(yè)化生產提供基礎資料。

1.5.1 培養(yǎng)時間對菌株生長及產生抑菌物質的影響

取1mL振蕩培養(yǎng)12h的細菌液（1×108CFU/mL）接種于30mL NYBD培養(yǎng)液中，28℃、160r/min培養(yǎng)，分別在4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h、36h、40h、48h、60h等時間取樣，每處理重復3次，以不接菌培養(yǎng)液為對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值。

1.5.2 裝液量對菌株生長的影響

在100mL三角瓶中分別裝入10mL、20mL、30mL、40mL、50mL NYBD培養(yǎng)液，滅菌后按3%接種量接入菌齡為12h的種子液（1×108CFU/mL），置32℃、160r/min培養(yǎng)24h，每處理重復3次，以不接菌培養(yǎng)液為對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值，計算不同裝液量處理下培養(yǎng)液的細菌含量。

1.5.3 溫度對菌株生長的影響

接種1mL振蕩培養(yǎng)12h的細菌液（1×108CFU/mL）于30mL NYBD培養(yǎng)液中，分別于20℃、24℃、28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃條件下160r/min培養(yǎng)24h，每處理重復3次，取培養(yǎng)液以不接菌培養(yǎng)液為對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值，計算不同溫度培養(yǎng)的細菌含量。

1.5.4 接種量對菌株生長的影響

取振蕩培養(yǎng)12h的細菌液（1×108CFU/mL）分別按1%、3%、5%、7%、10%的接種量接入30 mL NYBD培養(yǎng)液中，32℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h，每處理重復3次，以不接菌培養(yǎng)液為對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值，計算不同接種量處理下培養(yǎng)液的細菌含量。

1.5.5 不同初始pH值對菌株生長的影響

設置pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，28℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h，每處理重復3次，以不接菌培養(yǎng)液為對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值，計算不同pH值種子液的培養(yǎng)液的細菌含量。

1.5.6 轉速對菌株生長的影響

等量接種1.5mL的種子液（1×108CFU/mL）于20mL NYBD培養(yǎng)液中，在32℃條件下，分別80r/min、100r/min、120r/min、150r/min、180r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)24 h，每處理重復3次，以不接菌培養(yǎng)液為對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值，計算不同轉速振蕩條件下培養(yǎng)液的細菌含量。

全部數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0處理。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌平板篩選和鑒定

在燕麥培養(yǎng)基上通過平板對峙法初篩到31株對煙草疫霉有不同拮抗作用的菌株。通過初篩和復篩，經(jīng)過綜合比較選取其中拮抗效果稍好的細菌菌株做生理生化鑒定，編號為1205抑菌圈直徑（含濾紙片）達到了（20.5±0.19）mm。挑取抑菌圈周圍的煙草疫霉菌絲制片，對1205菌株顯微觀察到菌絲溶解，斷裂和膨大現(xiàn)象（圖1）。

圖1 1205 菌株和煙草黑脛病菌對峙培養(yǎng)抑菌帶內菌絲變化Fig.1 Mycelium change in bacteriostatic ring of 1205 strains andPhytophthora nicotianae confrontation culture

參考《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《芽孢桿菌屬》中有關芽孢桿菌屬的描述，對拮抗細菌形態(tài)特征進行觀察（表1）及生理生化測定（表2），結果表明，拮抗細菌菌體為革蘭氏陽性桿菌，均產芽孢，均有鞭毛，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

以1205菌株的基因組DNA為模板，PCR擴增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大約1.5kbp的特異性條帶（圖2），經(jīng)過菌株的16S rDNA序列經(jīng)測定，1205全長1468bp。將1205序列與GenBank中相關數(shù)據(jù)進行相似性分析的結果表明，在親緣關系相近的前20個序列都為蠟樣芽孢桿菌屬（Bacillus cereus）的菌株，綜合形態(tài)學及生理生化實驗可以將其鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

表1 拮抗細菌的形態(tài)觀察Table 1 Morphological observation of antagonistic bacteria

表2 拮抗細菌的生理生化反應Table 2 Physiological and biochemical reaction of antagonistic bacteria

圖2 1205的PCR擴增產物Fig.2 The PCR amplified products of 1205 strain

2.2 1205菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時間對菌株生長及產生抑菌物質的影響

1205的生物量見圖3，在2h～6h內急劇增加，8h～12h生長相對緩慢，12h～28h生長趨于平緩，28h后逐漸減少。結果表明，1205菌株的延遲期為0～2h，對數(shù)生長期為2h～12h，靜止生長期為12h～28h，28h以后進入衰亡期。1205菌株在28h的生物量（OD600nm）為2.812±0.06（Y=9.67X-18.03，R2=0.98），達到最大值，且抑菌物圈也達到最大值，為（10.4±0.11）mm，與其他時間存在顯著性差異。因此，綜合生物量與抑菌圈直徑，選擇28h作為1205菌株的最適培養(yǎng)時間。

圖3 培養(yǎng)時間對菌株生長及產抑菌物質的影響Fig.3 Effect of culture time on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.2 溫度對菌株生長的影響

該菌株在20℃～40℃范圍內均能生長，隨著溫度的升高生物量先增加后減少（圖4），在28℃生物量（OD600nm）為2.728，達到最大值，產生抑菌物質也是在28℃達到最大值（7.5±0.05）mm，且與其他溫度存在顯著性差異p＜0.05。因此，1205菌株的最適培養(yǎng)溫度為28℃。

圖4 溫度對菌株生長及產抑菌物質的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.3 裝液量對菌株生長的影響

在160 r/min的轉速條件下，隨著搖瓶裝液量的增加，1205菌株的生物量呈逐漸減少的趨勢（圖5）。抑菌圈先增加后減少，在20mL時達到最大值（8.14±0.07）mm且與其他裝液量存在顯著性差異，p＜0.05因此，在160 r/min的轉速條件下，綜合生物量及抑菌圈直徑，1205菌株最適裝液量為20mL/100mL。

2.2.4 接種量對菌株生長的影響

在所選取的接種量范圍內，1205菌株的生物量隨接種量的增加而先增加后減少（圖6）。接種量為3%時，菌株的生物量（OD600nm）為2.696±0.03，達到最大值。接種量大于3%時，菌株生物量逐漸減少，且在1%～7%的接種量范圍內其生物量及抑菌圈直徑均不存在顯著性差異p＞0.05，考慮到成本問題，選擇1%作為1205菌株的最適接種量。

圖5 裝液量對菌株生長及產抑菌物質的影響Fig.5 Effect of liquid volume on the growth of the strain and antibacterial substance production

圖6 接種量對菌株生長及產抑菌物質的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.5 不同初始pH值對菌株生長的影響

1205在pH5.0～8.0均能較好的生長，pH 8.0以上生長開始降低。在pH5.0、pH6.0和pH8.0時其生物量與抑菌圈直徑最大且不存在顯著性差異p＞0.05，因此，表明該菌的最適生長pH值在偏酸偏堿范圍內。在實際實驗操作中，培養(yǎng)基的自然pH值為6.0，因此，選擇pH6.0作為其最適起始pH值。

圖7 不同初始pH對菌株生長及產抑菌物質的影響Fig.7 Effect of initial pH on the growth of the strain and antibacterial substance production

2.2.6 轉速對菌株生長的影響

該菌株的生物量隨轉速的增加而先增加后減少（圖8）。在轉速為180r/min時1205菌株的生物量為OD值2.733±0.05達到最大值，同時產抑菌物質也最大為（8.808±0.09）mm，但與160r/min和200r/min時不存在顯著性差異p＞0.05，考慮能源成本問題，選擇160r/min作為1205菌株的最適搖瓶轉速。

圖8 轉速對菌株生長及產抑菌物質的影響Fig.8 Effect of rotational speed on the growth of the strain and antibacterial substance production

通過研究該株拮抗細菌的最佳發(fā)酵條件，表明1205菌株搖瓶振蕩的最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基為NYBD，接種量為1%，初始pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為28℃，裝液量為20mL/100mL，搖床轉速為160r/min，培養(yǎng)時間為28h。此條件下生物量（OD600nm）為2.937±0.03，抑菌圈達到（10.6±0.15）mm，效果顯著。

3 討論

有研究表明，對煙草疫霉有拮抗作用的細菌有芽孢桿菌（Bacillusspp.）和假單胞桿菌（Pseudomonasspp.），除細菌以外，土壤真菌中的青霉（Penicillumspp.）、木霉（Trichodermaspp.）等也是常見的拮抗菌[12]。但芽孢桿菌屬細菌具有抗菌譜廣、生長快、抗逆性強、使用安全、抗菌物質活性高、易于進行分子加工等特點[13-14]，本實驗中的蠟樣芽孢桿菌1205 在對黃瓜枯萎病菌具有良好的抑制作用，且抑菌特性穩(wěn)定，對外界環(huán)境有很強的耐受性和適應性[15-16]。其他方面，對煙草黑脛病防治報道很少。

本實驗以NYBD作為1205菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎培養(yǎng)基，對拮抗細菌菌株1205溫度、pH值、轉速、等進行優(yōu)化，進一步提高了發(fā)酵液中菌體的產生量，為工業(yè)化生產和大面積推廣應用提供理論依據(jù)。本研究僅涉及發(fā)酵條件對拮抗細菌菌體產生量和抑菌活性的影響，下一步將對其在拮抗作用機制和抗菌物質的有效成分等相關工作進行系統(tǒng)、具體的研究，預期今后在防治煙草疫霉方面有更加突出的價值。拮抗細菌1205實際大田生防效果正在研究，為今后田間煙草疫霉病生防制劑的開發(fā)提供堅實基礎。

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