不同釀酒原料青稞中揮發(fā)性物質(zhì)差異性研究

李春揚，黃新望，張曉磊*，安紅梅，尹建軍，宋全厚

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027）

白酒是我國傳統(tǒng)的飲料酒，因原料品種、地域、氣候及釀造工藝的差別而風(fēng)格各異。青稞酒作為一種特殊的產(chǎn)地酒是以青藏高原盛產(chǎn)的青稞為主要原料釀造，具有香氣純正、口味綿甜的風(fēng)格特征[1]。一直以來，青稞酒受到青藏地區(qū)廣大民眾的廣泛喜愛，為了滿足青稞酒消費群體日漸提高的消費需求，除在原有基礎(chǔ)上改進生產(chǎn)工藝外，從釀酒源頭出發(fā)設(shè)計出口感更加豐富的青稞酒對白酒企業(yè)來說無疑是推陳出新的好方法，擴大產(chǎn)品類型的同時也可迎合消費者的口感需求。而釀酒谷物原料的選擇就顯得尤為重要，不同的原料釀造出的成品酒的風(fēng)格迥異，同屬青稞但不同種類釀造出的青稞酒的口感亦是有所差異。因此，對青稞原料的研究有助于指導(dǎo)生產(chǎn)、開發(fā)新產(chǎn)品。

青稞主要生長在我國西北、西南特別是西藏和青海等地，以往的研究大都集中在對原料的理化特性如蛋白質(zhì)、脂肪的基礎(chǔ)研究上[2-5]，而對青稞的香味成分研究甚少[6]。青稞的香味組分是一類非常復(fù)雜，數(shù)目龐大的物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)各不相同，具有揮發(fā)性或半揮發(fā)性，而氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromalography-mass spectroretry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是分離、分析揮發(fā)性組分最強有力的技術(shù)之一，其充分結(jié)合了2種分析技術(shù)的優(yōu)點，即氣相色譜（gas chromatography，GC）的高效、快速、進樣量少和質(zhì)譜（MS）的高靈敏度、可對未知化合物進行定性鑒定的功能，適用于青稞中復(fù)雜揮發(fā)性化合物的剖析。

本研究建立在以往研究的基礎(chǔ)上[7-8]，綜合2種樣品前處理方法—同時蒸餾萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE）和頂空-固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合GC-MS分析瓦藍、肚里黃、白青稞、黑老鴨4種釀酒用青稞的香味組分并進行了比較，同時利用聚類分析（cluster analysis，CA）對4種青稞的種屬間的差異進行剖析，旨在對青稞原料的香味物質(zhì)進行初探，為后續(xù)研究原料與成品酒的品質(zhì)關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓦藍、肚里黃、白青稞、黑老鴨4種青稞原料由青海互助青稞酒有限公司提供。

二氯甲烷：色譜純，美國Baker公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

GC/MS-QP2010 Plus氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；SUPELCO 57304-u固相微萃取裝置（配有85μm PA萃取頭）：美國SUPELCO公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；HAD2513同時蒸餾萃取裝置：北京恒奧德儀器儀表有限公司；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；SE812J水浴氮吹儀：北京帥恩科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空-固相微萃取（HS-SPME）條件和同時蒸餾萃取（SDE）條件

頂空-固相微萃取條件參見以往研究的實驗條件[7，9]，同時蒸餾萃取條件參見張曉磊等[8]關(guān)于同時蒸餾萃取技術(shù)分析釀酒原料青稞中揮發(fā)性化合物的研究一文中的實驗方法。

1.3.2 GC-MS分析條件

色譜條件：所用色譜柱為CP-Wax 57 CB毛細管柱（50m×0.25mm×0.2μm），柱溫采用程序升溫，初溫35℃，保持3min后以3℃/min升至80℃，再以9℃/min升至200℃，保持20min。進樣口溫度為230℃，不分流進樣1min，載氣為氦氣。

質(zhì)譜條件：MS電離方式為電子點火（electron ignition，EI），電子能量70eV，離子源溫度230℃，質(zhì)譜掃描范圍50m/z～500m/z，質(zhì)譜分析用數(shù)據(jù)庫為美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011年版本。

1.3.3 多元統(tǒng)計分析

所用統(tǒng)計軟件為：IBM.SPSS Statistics 19.0，帶有聚類分析模塊。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的確定

樣品前處理方法種類繁多，如何選擇要依據(jù)各自的優(yōu)缺點綜合考慮。SPME法作為簡單易行的香味成分富集方法廣泛應(yīng)用于食品及香精香料的香味物質(zhì)分析[10-12]。不同于SPME方法，SDE方法建立在將青稞蒸煮的基礎(chǔ)上，一些敏感物質(zhì)極易氧化，如一些不飽和脂肪酸，萜類等在高溫下常發(fā)生氧化反應(yīng)[13-15]。鑒于青稞酒的制作工藝中首先是將青稞蒸煮后加曲發(fā)酵，因此通過將SDE法與SPME法相結(jié)合用于青稞的風(fēng)味分析，從而在一定程度上反映青稞酒制作過程香氣成分的變化，并且為后續(xù)研究青稞種類以及青稞酒發(fā)酵工藝對成品青稞酒的品質(zhì)的影響奠定理論基礎(chǔ)。因此，最終選擇頂空-固相微萃取和同時蒸餾萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時分析青稞揮發(fā)性香味組分。

2.2 HS-SPME和SDE方法對香味組分的定性、定量及結(jié)果比較

分別采用HS-SPME法和SDE法對4種青稞的香味物質(zhì)進行鑒別，相關(guān)數(shù)據(jù)參見以往研究[7-8]，因相同前處理方法得到4種青稞的色譜圖比較相似，因此僅列出具有代表性的瓦藍青稞中揮發(fā)性組分分別經(jīng)HS-SPME-GC/MS和SDE-GC/MS分析得到的總離子流圖分別見圖1、圖2。

圖1 HS-SPME-GC/MS分析瓦藍青稞中揮發(fā)性組分的總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatogram of the volatile components in Walan by HS-SPME-GC/MS

圖2 SDE-GC/MS分析瓦藍青稞中揮發(fā)性組分的總離子流圖Fig.2 Total ion current (TIC) chromatograms of the volatile components in Walan by SDE-GC/MS

采用HS-SPME法和SDE法結(jié)合GC/MS對4種青稞樣品的香味成分定性，采用面積歸一化法進行初步定量。共鑒定出包括酸、醇、酯、酮和芳香族化合物在內(nèi)的共30余種化合物[7-8]。采用2種方法鑒定的不同品種青稞的揮發(fā)性化合物種類部分相似又存在不同，同時其相對含量也有一定的差異，結(jié)果分別見表1和表2。

表1 4種青稞揮發(fā)性化合物HS-SPME法分析結(jié)果Table 1 Statistic table of volatile components in four kinds of highland barleys by HS-SPME

從表1可以看出，HS-SPME方法鑒定的4種青稞中：瓦藍酸類含量相對較高，而黑老鴨中醇類含量最高，同時肚里黃的酯類含量較其余3種青稞含量較高，而4種青稞的芳香族化合物、醛類化合物和酮類化合物含量均較低，差異不顯著。表1結(jié)果表明，不同種類青稞既有總體的相似度，又有突出的個體差異，這可能與青稞種類、不同地區(qū)的日照時間、海拔高度以及土壤肥沃程度等因素密切相關(guān)。頂空-固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析青稞中揮發(fā)性化合物的技術(shù)可滿足青稞品種間的區(qū)分和篩選，有助于原料青稞與成品酒的相關(guān)性研究。

表2 4種青稞揮發(fā)性化合物SDE法分析結(jié)果Table 2 Statistic table of volatile components in four kinds of highland barleys by SDE

通過SDE方法鑒定的青稞的揮發(fā)性成分[8]化合物統(tǒng)計見表2。由表2可知，其中醛類化合物在4種青稞中所占比例最大，均超過60%，而肚里黃和黑老鴨中醛類化合物含量最高；其次芳香族化合物亦占有很大比重，瓦藍較其他3種青稞的芳香族化合物最高，為21.7%；最后醇類化合物中白青稞的含量最高，為13.83%，而酮類化合物和酯類化合物的含量較低，在此不做進一步討論。

表1、表2結(jié)果表明，同一青稞品種采用不同的前處理方式所獲得的定性組分差異很大，這也印證了不同前處理方式的分析重點有所不同，其中SPME法對低分子質(zhì)量的醛、酸和醇等化合物檢出效果良好，對風(fēng)味物質(zhì)比較靈敏，由于前處理過程溫和，基本為青稞生粉的低沸點揮發(fā)性化合物，而SDE法沸點低、容易發(fā)生變化的化合物（如低分子質(zhì)量的醇、酸等）檢出較少，而如長鏈的醛等高沸點的組分及低揮發(fā)性的組分較多，這是由于SDE長時間保持微沸狀態(tài)，使半揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)更能充分溶于萃取劑中。因此，采用上述2種前處理方式結(jié)合GC-MS分析，可對不同品類的釀酒原料青稞中不同沸點范圍的風(fēng)味成分進行比較全面的分析，并可用于不同品種的判定。

2.3 四種青稞香味物質(zhì)的聚類分析

表3 4種青稞的聚類分析表Table 3 Cluster analysis of four kinds of highland barleys by SDE and HS-SPME

聚類分析是通過確定一些能夠度量樣品相似程度的統(tǒng)計量，將樣品按相似程度的大小區(qū)分為幾類，并最終逐級聚合為一類的分析方法[16]。采用HS-SPME和SDE前處理方法所得到的揮發(fā)性化合物分別作為輸入，執(zhí)行聚類分析，所得結(jié)果一致，見表3和圖3。

圖3 4種青稞的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis of four kinds of highland barleys by SDE and HS-SPME

通過聚類分析的樹狀圖3可以更直觀的看出各樣品在相似程度上的大小關(guān)系，圖3顯示了考察的4種青稞樣品之間的相似程度，其差異大小可以由上方坐標（0～25）表示。從圖3可以得出如下結(jié)論：

（1）瓦藍、肚里黃、黑老鴨與白青稞各自分類并在相似度差異為25時才聚為一類，說明4種青稞之間存在顯著差異，即4種青稞明顯可以聚為4類；

（2）其中的黑老鴨與肚里黃之間的種屬距離最近，相似度差異約為1，若將其分為3類，則黑老鴨與肚里黃聚為一類；

（3）若將其聚為2類時則白青稞獨成一類，其他3種聚為一類，與表3結(jié)果吻合。

因此，通過聚類分析，很直觀地看出4種青稞的種屬相似性及差異性，為后續(xù)釀酒前期選擇青稞品種提供一定的科學(xué)根據(jù)。

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合頂空-固相微萃取和同時蒸餾萃取分析青稞中揮發(fā)性化合物的方法，方法簡便、有效、實用。瓦藍、肚里黃、白青稞和黑老鴨等4種青稞類釀酒原料的綜合分析。結(jié)果表明，不同品種青稞的揮發(fā)性組分總體接近又各具明顯特征。同時通過聚類分析的結(jié)果可以探究4種不同青稞之間的種屬相似性，為后續(xù)研究不同青稞品種的篩選、區(qū)分和成品酒的質(zhì)量相關(guān)性提供了有效的技術(shù)手段，同時也拓展了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在白酒原料分析中的應(yīng)用。

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