頭孢曲松鈉預處理對局灶性腦缺血大鼠缺血周圍腦組織白介素1β和白介素6表達的影響

劉 暢，巴曉紅，閔連秋，劉學文

炎癥機制是腦缺血再灌注損傷的重要機制。炎性細胞在腦缺血過程中的激活和炎性遞質的釋放在腦缺血損傷中占有重要的地位。因此，有效抑制炎性細胞激活及炎性遞質釋放，從而阻斷炎性損傷是控制缺血性腦損傷的關鍵環節。本課題組前期研究表明，頭孢曲松具有抑制腦缺血后大鼠腦組織核因子κB (NF-κB)表達的作用，從而起到了神經保護作用[1]。而NF-κB不但參與炎性反應，其激活更與白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)等炎性遞質的表達密切相關。本研究通過制備大鼠局灶性腦缺血模型，研究頭孢曲松鈉對缺血周圍腦組織白介素1β(IL-1β)和IL-6表達的影響，以進一步探討其抑制腦缺血損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用健康雄性SD大鼠24只，體質量280～320 g(由遼寧醫學院動物實驗中心提供)，許可證號：SCXK(遼)2003-1007。應用隨機數字表法將大鼠隨機分為假手術組、模型組、預處理組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 預處理組大鼠每日腹腔注射頭孢曲松鈉(上海新先鋒藥業有限公司提供，規格1.0 g，批號080560)200 mg/kg，共5 d。假手術組和模型組大鼠分別給予等量的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，給藥方法及療程同預處理組。

1.2.2 大腦中動脈閉塞(MCAO)動物模型制備 參照文獻[2]，各組大鼠MCAO術前12 h禁食，以防手術時誤吸，不禁水。以10%水合氯醛3 ml/kg行腹腔麻醉，沿頸部正中行2～3 cm切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及翼腭動脈。結扎頸總動脈近心端及翼腭動脈，在頸總動脈分叉處結扎頸外動脈遠心端。于頸內動脈近心端置動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的尼龍線栓，去除動脈夾，沿頸內動脈輕輕向前推進至大腦前動脈(深18 mm左右)，結扎頸內動脈并固定線栓。假手術組大鼠術中不插入線栓，其余過程與上述相同。MCAO模型制備成功的判斷標準為大鼠即刻出現同側Horner征。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能評分 參考文獻[3]的方法進行神經功能評分：(1)0分，無神經缺損癥狀；(2)1分，輕微神經缺損癥狀，不能完全伸展對側前爪；(3)2分，中度局灶性神經缺損癥狀，爬行時向對側轉圈；(4)3分，重度局灶性神經缺損癥狀，行走時向對側傾斜；(5)4分，不能自發行走，意識改變。于大鼠MCAO術后約2 h清醒至24 h內進行3次神經功能評分，取平均值。

1.3.2 大腦皮質IL-1β和IL-6陽性表達的細胞數 MCAO術后24 h，用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，于頸正中偏右切開，以4%多聚甲醛約50 ml局部灌流內固定后，斷頭取腦。乙醇脫水，石蠟包埋，制成約5 μm厚的連續切片。將其進行免疫組化SABC法染色：脫蠟水化；熱修復；山羊血清封閉；滴加一抗(1∶100)、二抗；滴加試劑SABC；DAB顯色；蘇木素復染；脫水、透明及封片。于每張切片右側頂葉皮質和海馬CA1區各取5個高倍鏡視野(10×40)，陽性表達為細胞質內呈現棕黃色(IL-1β及IL-6均為細胞質染色)，按照陽性細胞數/(陽性細胞數+陰性細胞數)×100%計算陽性表達率。IL-1β和IL-6試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2 結果

2.1 頭孢曲松鈉預處理對局灶性腦缺血大鼠神經功能評分的影響 MCAO術后，3組大鼠神經功能評分間差異有統計學意義(P<0.05)；其中模型組、預處理組大鼠神經功能評分與假手術組比較，預處理組大鼠神經功能評分與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.01，見表1)。

2.2 頭孢曲松鈉預處理對大鼠腦缺血周圍組織中IL-1β、IL-6表達的影響 光學顯微鏡下發現：假手術組大鼠腦缺血周圍組織可見少量IL-1β陽性細胞；模型組大鼠IL-1β陽性細胞較則明顯增加；而預處理組大鼠IL-1β陽性細胞較模型組則明顯減少(見圖1)。假手術組大鼠腦缺血周圍組織可見少量IL-6陽性細胞；模型組大鼠IL-6陽性細胞增多，主要分布于缺血半暗帶皮質和海馬組織；而預處理組大鼠IL-6陽性細胞較模型組則明顯減少(見圖2)。

統計檢驗結果顯示，3組大鼠腦缺血周圍組織中IL-1β、IL-6陽性表達率間差異有統計學意義(P<0.05)；其中模型組、預處理組大鼠IL-1β、IL-6陽性表達率與假手術組比較，預處理組大鼠IL-1β、IL-6陽性表達率與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.01，見表1)。

3 討論

在腦缺血后數小時到數天都可以觀察到顯著的白細胞浸潤，其數量與腦梗死容積直接相關[4]。腦缺血時，血流速度減慢使中性粒細胞更易黏附于血管內皮細胞，啟動炎性反應[5]，同時引起氧自由基等物質釋放，加重組織水腫。研究表明，抑制中性粒細胞浸潤可以降低缺血再灌注損傷和改善預后[6]。在大鼠腦缺血模型中，應用中性粒細胞抑制因子可發揮明顯的神經保護作用，減少中性粒細胞浸潤和腦梗死容積[7]。

有研究發現，在缺血再灌注損傷后，炎性遞質大量表達，如IL-1β、IL-6、白介素8(IL-8)、白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白等，這些炎性遞質的表達與腦組織損傷預后密切相關[7-8]。白介素在腦缺血性損傷中扮演著重要的角色。其中IL-1β對組織損傷至關重要。IL-1β是 IL-1家族成員之一，能夠誘導炎性反應，激活內皮細胞的活化，增加一氧化氮、谷氨酸和過氧化物的釋放，介導腦組織的損傷[9]。IL-1β的 mRNA已經被證實在大腦皮質、紋狀體、海馬、丘腦等部位表達，并在大腦缺血后迅速激活并持續分泌，直到第7天[10]。相關實驗進一步確認外源性 IL-1β可以引起缺血性腦損傷的惡化，而在對小鼠行MCAO后，缺乏IL-1β的小鼠與野生型小鼠比較，明顯具有更小的腦梗死體積。在 MCAO術后急性期抑制IL-1β的表達，可以使腦梗死體積明顯減少[11]。本研究結果顯示，在 MCAO術后24 h，頭孢曲松鈉預處理的大鼠腦缺血周圍組織中IL-1β的陽性表達率較MCAO模型大鼠明顯下降，提示頭孢曲松鈉可以顯著降低大鼠缺血腦組織中IL-1β的表達水平，抑制炎癥的發生，可能是其神經元保護作用的重要機制之一。

Table1 Comparison of neurological scores and positive expression rate of IL-1β and IL-6 around ischemic tissue in the three groups

組別只數神經功能評分(分)IL-1β(%)IL-6(%)假手術組80 7.3±1.3 6.8±2.6 模型組82.5±0.9* 82.7±12.4* 69.3±10.2* 預處理組81.5±0.8*△52.7±9.9*△50.4±9.8*△F值44.33353.27179.64P值0.000.000.00

注：IL-1β=白介素1β，IL-6=白介素6；與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

圖1 3組大鼠局灶性腦缺血周圍組織中IL-1β的表達(SABC，×200)

Figure1 Expression of IL-1β around focal cerebral ischemia tissue in the three groups

圖2 3組大鼠局灶性腦缺血周圍組織中IL-6的表達(SABC，×400)

Figure2 Expression of IL-6 around focal cerebral ischemia tissue in the three groups

IL-6在腦缺血急性期是重要的炎性遞質，可導致腦炎性損傷[12]；且外周血中的IL-6水平是反映腦缺血損傷早期的敏感性指標。有研究顯示，MCAO模型中IL-6在外周血2 h即開始上升，早于腦組織開始上升時間(24 h)[13]。已經有研究表明，缺血再灌注損傷發生后，腦內IL-6的水平上升，IL-6 mRNA在局灶性腦梗死后同樣表達上調。IL-6 的快速表達在時間上與其他炎性遞質相似，在缺血后6 h已經有明顯上升，并考慮與腦梗死容積有一定相關性[14]。本研究結果顯示，假手術組大鼠皮質僅有基礎水平的IL-6表達，而MCAO模型大鼠IL-6陽性表達率則顯著增加，提示IL-6參與了腦缺血損傷過程。與MCAO模型大鼠比較，頭孢曲松鈉預處理大鼠腦缺血周圍組織中IL-6陽性表達率顯著降低，提示頭孢曲松鈉可以抑制腦缺血后IL-6的表達。

總之，本研究結果提示IL-1β、IL-6均參與了缺血性腦損傷的病理生理過程，而頭孢曲松鈉具有抑制腦缺血后大鼠腦組織IL-1β、IL-6表達的作用，通過抑制損傷后炎性反應來發揮神經保護作用。

1 劉暢，賈玉潔，姜興千，等.頭孢曲松鈉對局灶性腦缺血大鼠腦組織Fas和NF-κB表達的影響[J].中國老年學雜志，2012，32(19)：4210-4212.

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14 李輝萍，徐偉，宋治，等.重復經顱磁刺激對急性腦梗死患者血清白介素-6水平及神經功能康復的影響[J].中國全科醫學，2010，13(11)：3709.