酪氨酸激酶2基因多態(tài)性與漢族人群急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病的關(guān)聯(lián)研究

婁 濤，李文強(qiáng)，顧家鵬，李時(shí)光，顧仁駿，張 萍，王夏紅，張紅星，

李 巍，張紅亞，趙建民，潘 登，李 靜，靳 玫，吳 強(qiáng)

急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACMP)是較常見的職業(yè)性及生活性中毒，可造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)功能損害為主的全身各組織細(xì)胞的損傷[1]。部分ACMP患者經(jīng)治療意識(shí)清醒后,經(jīng)過3～60 d〔平均(23.8±14.0)d〕表現(xiàn)正常或接近正常的間歇期，會(huì)出現(xiàn)急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)，該病是以癡呆、精神失常和錐體外系癥狀為主要表現(xiàn)的一組神經(jīng)精神癥狀。DEACMP的影像及病理改變主要為雙側(cè)蒼白球?qū)ΨQ性軟化灶和大腦白質(zhì)廣泛的脫髓鞘，海馬區(qū)亦有不可逆損害等[2-3]。目前認(rèn)為急性中毒后缺氧損傷導(dǎo)致血-腦脊液屏障開放產(chǎn)生的自身免疫反應(yīng)是其重要的病理機(jī)制[4-5]，但年齡、性別類似且中毒程度相同的患者發(fā)生概率又有很大的差別，提示存在個(gè)體間的差異，推測個(gè)體遺傳因素可能起到了重要的作用。DEACMP的早期病理改變—腦白質(zhì)廣泛的脫髓鞘及晚期病理改變—腦萎縮等特點(diǎn)均與多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)類似，兩者同屬于獲得性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，在腦部病理損傷中有著許多共同之處。關(guān)于DEACMP的基因研究目前相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)選取MS易患基因酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)[6-7]的rs10876994和rs34536443位點(diǎn)，研究TYK2基因多態(tài)性與DEACMP的遺傳易患性之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2006年10月—2010年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院等11家醫(yī)院急診科和神經(jīng)內(nèi)科住院的ACMP昏迷患者224例，鑒于30歲以下DEACMP患者極為罕見，為了達(dá)到相對匹配，研究對象入組年齡定為40歲以上。DEACMP符合內(nèi)科學(xué)第六版診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，ACMP符合國家職業(yè)性ACMP診斷標(biāo)準(zhǔn)GB8781-88。均排除以下情況：過敏史；近2周內(nèi)發(fā)生感染；接受過免疫抑制劑治療及激素治療；近半年內(nèi)接受過預(yù)防接種；嚴(yán)重的心、肝、腎疾病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；嚴(yán)重的糖尿病、內(nèi)分泌疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、營養(yǎng)不良、酒精依賴及其他精神疾病；妊娠、哺乳及月經(jīng)期婦女。由于DEACMP的假愈期最長為60 d，因此對ACMP患者均隨訪90 d以上，根據(jù)是否出現(xiàn)DEACMP分為兩組。DEACMP組共109例，其中男55例，女54例；年齡42～89歲，平均(59.7±9.7)歲。ACMP時(shí)均有昏迷史，昏迷持續(xù)時(shí)間(發(fā)現(xiàn)昏迷到意識(shí)清醒的時(shí)間)2～72 h，平均(16.1±15.1)h。間歇期(ACMP昏迷清醒后到出現(xiàn)遲發(fā)性腦病癥狀的時(shí)間)7～45 d，平均(20.3±9.4)d。ACMP組共115例，其中男50例，女65例；年齡40～84歲，平均(56.1±7.4)歲。ACMP時(shí)均有昏迷史，昏迷持續(xù)時(shí)間1～51 h，平均(6.8±7.5)h。兩組均為豫北地區(qū)漢族患者，兩組間性別、年齡具有均衡性。經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組對象或其法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 所有受試者采集外周靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝低溫凍存待用。采用天根生化科技RelaxGene血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 rs10876994和rs34536443位點(diǎn)基因分型 rs10876994、rs34536443位點(diǎn)引物序列設(shè)計(jì)和TaqMan MGB熒光探針序列設(shè)計(jì)均由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AB公司)完成。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7900 PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)AmpliTaq Gold Enzyme活化95 ℃ 10 min；(2)PCR(60個(gè)循環(huán))：變性92 ℃ 15 s，退火60 ℃ 60 s，延伸60 ℃ 60 s。反應(yīng)完成后直接由ABI 7900掃描讀取數(shù)據(jù)，產(chǎn)生結(jié)果并保存。對基因分型進(jìn)行質(zhì)量控制，隨機(jī)抽取20例樣本委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司采用ABI 3730基因測序儀對2個(gè)位點(diǎn)所在區(qū)域進(jìn)行DNA直接測序，分析其基因型。

1.2.3 神經(jīng)心理學(xué)評(píng)估 患者入院后每3 d評(píng)估一次長谷川癡呆量表(HDS)、常識(shí)-記憶-注意測驗(yàn)(IMCT)、日常生活能力量表(ADL)，直至治療顯效時(shí)為止[8]，3種智力量表取最差值。

2 結(jié)果

2.1 基因分型質(zhì)量控制 熒光定量PCR基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果符合率為99.25%。樣本尺寸224能提供0.81的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，發(fā)現(xiàn)對基因型分布的微效影響(r=0.10～0.23)。rs34536443位點(diǎn)在研究群體內(nèi)無多態(tài)性，在后續(xù)分析里剔除。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果 rs10876994位點(diǎn)基因型分布在全部樣本中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.43,P=0.12)。

2.4 神經(jīng)心理學(xué)分析 不同基因型患者ADL和IMCT評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同基因型患者HDS評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表2 兩組不同性別rs10876994位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表1 兩組rs10876994位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表3 rs10876994位點(diǎn)不同基因型患者神經(jīng)心理學(xué)的比較分)

注：HDS=長谷川癡呆量表，IMCT=常識(shí)-記憶-注意測驗(yàn)，ADL=日常生活能力量表；與AA攜帶者比較，*P<0.05；與AC攜帶者比較，△P<0.05

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病是以腦和脊髓髓鞘破壞或脫失病變?yōu)橹饕卣鞯募膊。ㄟz傳性和獲得性兩大類。獲得性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病可分為繼發(fā)于其他疾病的脫髓鞘病和原發(fā)性免疫介導(dǎo)的炎性脫髓鞘病。前者包括缺血缺氧性疾病(如DEACMP)、營養(yǎng)缺乏性疾病(亞急性聯(lián)合變性)等，后者包括MS、視神經(jīng)脊髓炎等。此類疾病發(fā)病多集中在自身免疫損傷和髓鞘結(jié)構(gòu)破壞兩大環(huán)節(jié)，且具有遺傳易患性[9]。DEACMP屬于典型的繼發(fā)性脫髓鞘病，病理改變和臨床表現(xiàn)與MS等疾病具有諸多相似性。目前認(rèn)為DEACMP是由于缺血缺氧導(dǎo)致腦組織壞死和血-腦脊液屏障開放，激發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)性髓鞘受損，導(dǎo)致在神經(jīng)損傷和修復(fù)過程中出現(xiàn)的一系列神經(jīng)和精神癥狀[2]。該病的發(fā)生與否及病情進(jìn)展的程度與中毒程度、搶救措施、患者身體狀況均有關(guān)。本課題組前期對豫北地區(qū)10年內(nèi)405例DEACMP患者的發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查，年齡和中毒程度基本相同的74對ACMP夫妻患者中同時(shí)患DEACMP者僅有10對，且與中毒的嚴(yán)重程度無關(guān)。說明除年齡、中毒程度外還有其他因素影響DEACMP的發(fā)生，提示DEACMP患者在對ACMP后的解毒、免疫損傷、細(xì)胞凋亡等方面可能存在個(gè)體差異，推測個(gè)體遺傳因素可能起到了重要的作用。

人TYK2基因是非受體型蛋白酪氨酸激酶，與Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞因子受體結(jié)合，通過磷酸化受體的亞基放大信號(hào)，是免疫激活和抗病毒感染的重要角色[10]。白介素6、白介素12、一氧化氮合成酶(NOS)、干擾素等的激活均與其有關(guān)。有報(bào)道證實(shí)TYK2是MS的易患基因[5-7,11]，推測可能是該基因的變異改變了其表達(dá)產(chǎn)物的活性，對下游信號(hào)的傳遞和放大產(chǎn)生影響，與其他基因共同導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。在對DEACMP患者外周血清的研究發(fā)現(xiàn)白介素6、白介素10和NOS均高于對照人群[3-4,12]，提示了DEACMP也可能有TYK2基因的參與。本研究比較了該基因的rs10876994和rs34536443位點(diǎn)在豫北漢族DEACMP組和ACMP組人群中的分布，發(fā)現(xiàn)兩組間無差異。按性別分層后，兩組間仍無差異。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，rs10876994位點(diǎn)不同基因型攜帶者在病情最嚴(yán)重時(shí)的ADL和IMCT有差異，AA基因型攜帶者表現(xiàn)出了較輕的神經(jīng)心理學(xué)缺陷，表現(xiàn)為保護(hù)因素。臨床癥狀關(guān)聯(lián)的研究結(jié)果在精神疾病研究中并不少見，林鄞等[13]最近就報(bào)道了G72 基因rs947267多態(tài)性與雙相情感障礙患者的認(rèn)知功能存在關(guān)聯(lián)，但該位點(diǎn)與疾病的關(guān)聯(lián)分析只得到了陰性結(jié)果。這些易患基因可能通過影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能等，在一定條件下引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙所致的認(rèn)知和行為紊亂。臨床癥狀的關(guān)聯(lián)將有助于更細(xì)致地理解復(fù)雜性遺傳疾病微效基因的易患機(jī)制。

本研究結(jié)果雖未證實(shí)TYK2基因與EDACMP的遺傳關(guān)聯(lián)，但神經(jīng)心理學(xué)功能與本研究多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)提示TYK2基因可能參與了該病的發(fā)生發(fā)展。未來應(yīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對TYK2基因在ACMP及DEACMP發(fā)生過程中的基因表達(dá)變化進(jìn)行研究，在遺傳水平上也應(yīng)加大樣本量，增加臨床表型的采集和分析，最終闡明TYK2基因與DEACMP的關(guān)系。

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