吉西他濱聯合溶瘤型腺病毒治療大腸癌的體外研究

渠紅霞，袁彩君，王 越

在世界范圍內，大腸癌在癌癥的病死率中排第4位，每年有100多萬的大腸癌新發病例[1]，國內的發病率也呈上升趨勢。大腸癌的治療主要依靠手術，晚期治療主要以化療為主，但是療效不甚理想，為了尋求新的治療方法，全世界的研究學者把目光投向了溶瘤型腺病毒。溶瘤型腺病毒又稱選擇復制性腺病毒，其能夠在腫瘤細胞中選擇性復制，但不能在正常細胞中復制，因具有可復制、體積小、彌散能力強等優點，近年來成為腫瘤生物治療的熱點[2-3]。

目前研究較多的溶瘤型腺病毒是Barker和Berk研發的E1B缺失腺病毒ONYX-015。ONYX-015又稱dl1520,是敲除了編碼55 kDa蛋白的E1B區2496-3323核苷，且在E1B區的2022位點上C改變為T，使得dl1520感染的宿主細胞無法編碼55 kDa蛋白[4]。因其具有眾多優點已進入臨床Ⅲ期試驗[5]，同時已有研究表明，dl1520在與化療藥物聯合應用時還可增加其療效。與dl1520相似，ZD55同樣是編碼E1B 55 kDa核酸缺失型溶瘤型腺病毒，但是ZD55可攜帶外源抗腫瘤基因，ZD55的優點使得其被多數學者應用于溶瘤型腺病毒攜帶外源抗腫瘤基因的分子治療。但是腺病毒的安全性部分是基于在人類正常細胞中復制缺陷的特性,而目前應用的溶瘤型腺病毒來自野生腺病毒,有一定回復突變的危險性[6]。因此鑒于腺病毒的特性，dl1520在治療腫瘤時可能存在安全隱患。

鹽酸吉西他濱(Gem)化學名為2′-脫氧-2′，2′-二氟胞苷鹽酸鹽(β-異構體)，是美國禮來公司研發的核苷類抗代謝抗腫瘤藥物。有報道指出Gem與腺病毒聯合應用時能獲得良好的腫瘤細胞殺傷效果，且對病毒在細胞內復制有一定的抑制作用[7-8]。本研究以體外培養大腸癌細胞系HCT-116及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為研究模型，單獨或聯合應用Gem和E1B缺失溶瘤型腺病毒，觀察其對腫瘤細胞的殺傷作用及安全性。

1　材料與方法

1.1實驗材料dl1520、ZD55和重組腺病毒(Ad-GFP)購自上海信裕生物科技有限公司，HCT-116和HUVEC購自中科院上海細胞生物學研究所，MTT購自Biosharp公司，McCOY′s5A培養基購自GIBCO公司，高糖DMEM培養基、青鏈霉素(PS)及胎牛血清購于天津永大化學試劑有限公司，Gem購于江蘇豪森藥業股份有限公司，5氟尿嘧啶(5-Fu)購于南通海爾斯醫藥有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥品制備細胞均采用貼壁培養法，HCT-116在McCOY′s5A培養基中培養；HUVEC在高糖DMEM培養基中培養，以上兩種培養基均含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)。細胞置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)飽和濕度下培養，每2～3 d傳代1次，培養至對數生長期(第3天)以0.25%胰酶消化進行實驗。Gem或5-Fu用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成合適濃度母液，過濾除菌后分裝保存在4 ℃冰箱待用。

1.2.2病毒感染率的測定取對數生長期細胞HCT-116(1×105)與HUVEC(5×104),接種于24孔培養板中，24 h細胞貼壁后，棄掉完全培養基，用無血清培養基稀釋Ad-GFP以感染復數(MOI)=0、1、10、100感染細胞，4 h后更換為完全培養基繼續培養，感染72 h后在熒光顯微鏡下計數綠色熒光蛋白(GFP)細胞，同時在可見光下計數該視野內的總細胞數，實驗重復3次，計算感染率。感染率=GFP陽性細胞數/該視野內的總細胞數。

1.2.3細胞存活實驗取對數生長期細胞HCT-116和HUVEC分別以1×104cell/孔、5×103cell/孔的密度接種于96孔培養板，培養24 h，待細胞貼壁生長良好后吸去培養基，按實驗分組加入病毒和(或)藥物。實驗設3個大組、8個小組：(1)單獨病毒組:dl1520組和ZD55組；(2)聯合組：dl1520聯合Gem組、ZD55聯合Gem組、dl1520聯合5-Fu組、ZD55聯合5-Fu組；(3)單藥組：Gem組和5-Fu組。前兩大組均以MOI=10的無血清培養基稀釋的相應病毒100 μl/孔感染上述細胞，單藥組以無血清培養基饑餓4 h后，與前兩組一起更換為完全培養基，置于37 ℃，5%CO2孵箱內培養24 h，在聯合治療組中，感染24 h后加入Gem或5-Fu，藥物濃度為10 μmol/L，在單藥治療組中細胞鋪板48 h后加入Gem或5-Fu，藥物濃度為10 μmol/L。設3個復孔，四周孔及間隙加無菌PBS 100 μl保濕，于37 ℃、5%CO2孵箱內培養72 h，鋪板5 d后(即感染4 d后)結束實驗，加入MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃孵育4 h后小心吸棄孔內上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl/孔，振蕩10 min，用酶標儀測570 nm波長吸光值，根據以下公式計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(實驗組OD均值-空白對照組OD均值)/(細胞對照組OD均值-空白對照組OD均值)×100%。

1.2.4細胞形態學觀察取對數生長期細胞HCT-116和HUVEC分別以1×105cell/孔、5×104cell/孔，接種于24孔培養板中，24 h細胞貼壁后，棄單藥組，按上述細胞存活實驗分組感染病毒及加入藥物。鋪板5 d后(即感染4 d后)結束實驗，于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5病毒滴度檢測取對數生長期細胞HCT-116和HUVEC分別以1×105cell/孔、5×104cell/孔，接種于24孔培養板中，24 h細胞貼壁后，棄單藥組，按上述細胞存活實驗分組感染病毒及加入藥物。鋪板5 d后(即感染4 d后)結束實驗，收集各組細胞，PBS洗3次，-80 ℃凍溶3次，離心，取上清液，用TCID50測定病毒滴度，Karbers公式計算病毒滴度。

2　結果

2.1病毒感染率測定MOI=100時，HCT-116和HUVEC對腺病毒的感染均較敏感，且細胞的感染率均達到90%以上(見圖1)。

2.2細胞存活率不同組HCT-116和HUVEC存活率比較，差異均有統計學意義〔F=18.546,P=0.000,95%CI(68.318,88.285)；F=37.079,P=0.000,95%CI(81.618,92.737)，見表1〕。

表1不同組HCT-116和HUVEC細胞存活率比較(%)

Table1Comparison of HCT-116 and HUVEC cells survival rate in different groups

組別HCT-116HUVECdl1520組84.5293.99ZD55組84.2985.92dl1520聯合Gem組62.1081.20ZD55聯合Gem組65.1080.80dl1520聯合5-Fu組73.1083.70ZD55聯合5-Fu組72.1081.10Gem組90.1094.265-Fu組95.1096.45

注：HUVEC=人臍靜脈內皮細胞

2.3細胞形態學HCT-116和HUVEC dl1520聯合Gem組和5-Fu組均可部分殺傷細胞，ZD55聯合Gem組細胞殺傷效果略遜于dl1520聯合Gem組，dl1520組和ZD55組中只可少部分殺傷細胞(見圖2、3)。

2.4滴度檢測和病毒復制實驗MTT實驗顯示，大腸癌細胞系HCT-116中dl1520聯合Gem組、ZD55聯合Gem組分別比dl1520組、ZD55組病毒滴度降低約400倍、50倍，dl1520聯合5-Fu組、ZD55聯合5-Fu組比dl1520組、ZD55組降低不明顯；正常細胞系HUVEC中病毒滴度降低不明顯(見圖4)。

圖4　TCID50檢測

圖1　MOI=100時細胞感染率

圖2　HCT-116細胞形態學實驗(光學顯微鏡，×400)

圖3　HUVEC細胞形態學實驗(光學顯微鏡，×400)

3　討論

目前溶瘤型腺病毒治療腫瘤已成為當今的熱點之一，許多臨床試驗已證實溶瘤型腺病毒對多種惡性腫瘤都有一定的治療效果，包括顱腦腫瘤、頭頸部腫瘤、腹膜轉移腫瘤、結腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肝臟腫瘤、骨肉瘤、腎臟腫瘤等[9-17]。而dl1520是溶瘤型腺病毒中研究最深入最廣泛的一種類型，是2型血清腺病毒與5型血清腺病毒的嵌合體，有許多學者認為dl1520的選擇復制機制與P53的功能突變有關，但并不僅限如此[18]。腺病毒dl1520進入腫瘤細胞后病毒大量復制,最終導致腫瘤細胞凋亡[19-20]。在腫瘤破裂時大量病毒被釋放，而當病毒數量達到一定程度時就可能會對人體產生一些目前還未完全了解的危害或疾病，因此其在治療腫瘤方面可能存在很多安全隱患。

本研究就是針對腺病毒在治療大腸癌時在保證殺傷效果不受影響的前提下如何抑制病毒增殖所做的研究，通過在一定程度上抑制病毒復制來提高腺病毒治療大腸癌的安全性。在本實驗中，各聯合組對大腸癌細胞系HCT-116的細胞殺傷作用雖然無差異，但是值得關注的是dl1520聯合Gem時病毒在大腸癌細胞系HCT-116內病毒滴度比單獨應用dl1520時降低約400倍，而dl1520聯合5-Fu時，沒有觀察到病毒滴度明顯降低，這就說明Gem與dl1520聯合應用能使細胞內病毒復制減弱，而5-Fu則不能。雖然Gem與5-Fu相比單獨或聯合應用時在殺傷腫瘤細胞效果上無差異，而Gem與溶瘤型腺病毒的聯合應用在治療大腸癌上的意義是毋庸置疑的，這就說明dl1520聯合Gem治療大腸癌是有意義的，而其中最引人注目的是二者的聯合應用能抑制細胞內病毒增殖，進而提高了溶瘤型腺病毒在治療大腸癌的安全性。然而與dl1520相比，ZD55聯合Gem或5-Fu治療大腸癌細胞系HCT-116時，其病毒滴度無明顯降低。與ZD55相比dl1520是嵌合型腺病毒，而ZD55是由野生型腺病毒構建而來，假設ZD55更加接近野生血清5型腺病毒，相對來講可能更加難以被抑制。

已有研究證實5-Fu、順鉑等藥物不能抑制病毒的復制[4]，但是5-Fu聯合溶瘤型腺病毒能夠有效提高治療大腸癌的療效。同時已有學者證實溶瘤型腺病毒突變體與Gem聯合應用在一定程度上能夠抑制病毒復制，機制可能為病毒溶瘤早期細胞膜破裂后引起的化療藥物的滲透和(或)線粒體功能失調而導致的細胞死亡[20]，從而導致病毒不能在腫瘤細胞中復制。也有學者認為導入外源基因磷酸化Gem等核苷酸類似物、摻雜入DNA鏈或RNA鏈可阻止病毒在細胞中的大量復制。本研究結果與上述的觀點有相對一致性，認為除了上述原因外，人類癌細胞的核苷酸激酶具有一部分催化Gem等核苷酸類似物的活性，從而抑制病毒增殖的作用，但是具體機制及改建后的溶瘤型腺病毒的復制因素仍需進一步研究。

Gem聯合dl1520治療大腸癌比單獨應用dl1520治療大腸癌有效，且在療效上與5-Fu的聯合無差異，但是與Gem的聯合能夠提高其安全性；而dl1520與5-Fu的聯合則不能提高其安全性，ZD55與Gem和5-Fu的聯合也說明了這點。本研究可能為將來大腸癌新的治療方法提供一定的依據，但是本實驗尚有不足之處，現在僅處于基礎研究階段，而目前dl1520聯合Gem能夠降低病毒滴度的機制不十分清楚，可能與Gem是核苷酸類似物，進而影響DNA合成有關，這還需要進一步的研究。

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