復發性流產與蛻膜組織中妊娠相關血漿蛋白A的關系研究

楊 君，王慧玲，華方方

復發性流產是指連續2次及以上的自然流產，是妊娠期婦女的常見并發癥之一[1]。目前關于復發性流產的病因尚不完全清楚，約80%的流產者不存在生殖道感染、解剖、內分泌、遺傳和自身免疫功能異常等病因[2]。妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)是由胎盤合體滋養層細胞和蛻膜細胞合成的母體血漿糖蛋白，研究顯示其在早期配子的發育、受精卵的著床、妊娠的維持以及胎兒和胎盤的生長發育等方面均發揮重要作用[3]。其表達水平隨著孕周的增加而增高，筆者在臨床工作中發現PAPP-A水平在復發性流產孕婦蛻膜組織中的表達水平低于正常孕婦，本研究即探討了蛻膜組織中PAPP-A水平與復發性流產之間的關系，現報道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料病例入選標準：(1)患者染色體檢查正常，無家族性遺傳病史，家族中未出現過自然流產者；(2)患者生殖道感染檢測呈陰性；(3)抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體及抗子宮內膜抗體檢查均為陰性；(4)無自身免疫性疾病、內分泌疾病等；(5)無心腦血管疾病及其他傳染性疾病病史；(6)配偶生殖系統和精液功能正常；(7)無吸煙、酗酒等不良生活習慣。選擇2010年6月—2012年6月我院收治的復發性流產孕婦39例作為復發性流產組(RSA組)，年齡27～41歲，平均(33.1±5.4)歲；孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。選擇同時期在我院進行人工流產的健康早孕婦女30例作為對照組，年齡23～40歲，平均(32.1±5.2)歲；孕期為5～8周，平均(6.5±0.9)周。兩組受試者的年齡、孕周間具有可比性(t=0.143、0.217,P>0.05)。

1.2實驗材料與儀器蛻膜組織均通過負壓吸引術獲得，于液氮中保存使用；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自大連寶生物；SYBY Green MiX 購自羅氏生物；96孔板購自Applied Biosystems；小鼠抗人PAPP-A單克隆抗體購自美國Abcam公司；羊抗鼠二抗購自Santa-cruz公司；DAB顯色液購自北京中杉生物技術有限公司；蘇木精購自北京中杉生物技術有限公司；國產分析純試劑；Real-time PCR擴增儀購自Applied Biosystems；LEICA RM2245石蠟切片機購自萊卡上海分公司；OLYMPUS BX5l顯微鏡購自日本奧林巴斯。

1.3實驗方法

1.3.1熒光定量PCR(RT-PCR)分析PAPP-A mRNA水平將蛻膜組織從液氮中取出，置于1 ml Trizol試劑中，勻漿后加入200 μl的氯仿，振蕩混勻后冰上放置5 min，12 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，向離心管中加入1 ml預冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩5下后8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的溶液溶解，定量后采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，作為RT-PCR的模板。

PAPP-A引物，上游：5′-CTACTTGGATGTTAATGAGC-3′；下游：5′-TCCTGCCAACTCCTCCTCTG-3′。Actin作為內參，上游：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3′；下游：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀釋為10 μM。反應體系如下：2×SYBR?Premix ExTaqTM 10 μl，上游引物和下游引物各0.6 μl，cDNA模板1∶100稀釋后取8.8 μl，總體積20 μl。按比例配制上述反應液后分裝于96孔PCR板，每孔20 μl，然后以1 000 r/min離心2 min。PCR反應條件如下：預變性：95 ℃,30 s；變性：95 ℃,3 s；退火延伸：60 ℃,30 s；構建溶解曲線。表達量的計算采用ΔΔt模式。

1.3.2免疫組化分析PAPP-A水平將RSA組和對照組蛻膜組織用石蠟包被，切成5 μm厚的切片，貼于載玻片上進行脫蠟處理，結束后用磷酸鹽吐溫(PBST)緩沖液沖洗3次，用3%過氧化氫-甲醇液浸泡除去內源性的過氧化氫酶，PBST緩沖液沖洗3次后將玻片置于檸檬酸緩沖液中，微波加熱進行抗原修復，冷卻至室溫后PBST緩沖液沖洗3次，用10%的山羊血清室溫封閉1 h，然后用10%山羊血清稀釋的一抗工作液4 ℃孵育過夜。次日在室溫回溫1 h后用PBST緩沖液沖洗3次，用二抗工作液室溫孵育30 min,PBST緩沖液沖洗3次后DAB顯色2～10 min，邊顯色邊觀察，著色后用自來水沖洗掉顯色液，蘇木精復染30 s，然后梯度乙醇脫水并用中性樹脂封固。同時設立陰性和陽性對照。陽性評定標準:所有切片均采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像系統分析。每張切片隨機選取10個視野，放大400倍，分析陽性細胞占總細胞數的比例，分為4個等級，陰性(-)：陽性細胞數<5%；弱陽性(+)：陽性細胞數5%～25%；中等陽性(++)：陽性細胞數26%～50%；強陽性(+++)：陽性細胞數>50%。并采用Motic Med 6.0 數碼醫學圖像系統對標本進行定量分析。

2　結果

2.1RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平比較從蛻膜組織中提取的RNA經紫外線分析，光密度(OD)260/OD280為1.9～2.0，說明RNA純度較高，未受到DNA和蛋白質污染。并采用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，作為RT-PCR的模板。RSA組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平較對照組下降，差異有統計學意義(t=3.152,P<0.05，見圖1)。

圖1　RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平比較

Figure1Comparison of PAPP-A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A水平比較PAPP-A表達于蛻膜細胞的胞質中(見圖2A)。兩組PAPP-A表達程度間差異有統計學意義(u=4.995，P=0.000),其中RSA組PAPP-A表達以強陽性為主，對照組主要以弱陽性為主(P<0.05，見表1)。對RSA組和對照組標本進行定量分析顯示，RSA組PAPP-A表達水平較對照組下降(t=2.591，P<0.05，見圖2B)。

2.3PAPP-A蛋白與復發性流產的關系以PAPP-A水平、年齡、孕周為自變量，以是否發生復發性流產為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示PAPP-A水平是導致復發性流產的危險因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信區間(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer-Lemeshow擬合優度檢驗結果顯示PAPP-A水平對復發性流產的預測具有較好的校準度(χ2=3.158，P<0.05)。

表1RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A的表達程度比較

Table1Comparison of PAPP-A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

組別例數-++++++對照組30219* 8 1 RSA組390 7 1121*

注：與組內其他表達程度比較，*P<0.05

注：A為PAPP-A的組織分布，B為PAPP-A的水平比較

圖2RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A的組織分布及水平比較

Figure2Comparison of PAPP-A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3　討論

復發性流產占妊娠總數的1%，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷，目前已經成為臨床研究的焦點[4]。但復發性流產的發病機制比較復雜，包括染色體異常[5]、內分泌異常[6]、免疫功能異常[7]、生殖器異常、感染因素[8]、全身性疾病、創傷刺激、不良生活習慣及環境因素等。但是約80%的復發性流產沒有明確的病因[9]。近年來，隨著臨床研究的不斷深入，發現PAPP-A在復發性流產孕婦中表達異常，因此本研究探討了其與復發性流產之間的關系，旨在為臨床診斷復發性流產提供一定的參考價值。

PAPP-A是與妊娠密切相關的一類大分子糖蛋白，近年來，研究顯示其在早期胚胎發育、受精卵著床、妊娠期維持、胎兒和胎盤生長以及發育過程中發揮重要作用[10]。PAPP-A主要由胎盤滋養層合體細胞和蛻膜細胞產生，然后分泌入血，從妊娠后第5周起可在孕婦血清中檢測到，并隨著孕周的增加其水平逐漸升高，到妊娠末期達到最高峰，產后水平逐漸下降[11]。目前PAPP-A已成為臨床早孕診斷和胎兒健康程度的主要監測指標。筆者在長期臨床研究中發現，復發性流產孕婦血清中PAPP-A水平明顯低于正常孕婦，這一結果跟目前部分報道一致[12]。

本研究顯示，與對照組比較，復發性流產孕婦蛻膜組織中PAPP-A mRNA的水平明顯下降；為了進一步分析PAPP-A水平，采用免疫組化的方法分析了蛻膜組織中PAPP-A的表達變化，結果顯示復發性流產孕婦蛻膜組織中PAPP-A水平明顯低于對照組，蛻膜組織中PAPP-A的表達下調導致了入血的PAPP-A水平下降，所以表現為復發性流產孕婦血清中PAPP-A水平低于對照組孕婦。進一步行Logistic回歸分析顯示PAPP-A水平下調是導致復發性流產的危險因素，提示其在復發性流產診斷中具有較好的準確性。

綜上所述，PAPP-A在復發性流產蛻膜組織中表達水平明顯下調，其下調是導致發生復發性流產的原因之一。

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