普伐他汀與阿托伐他汀對急性損傷大鼠心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

孫曉靖，陳玉嵐，張向陽，楊少玲，黃 定，王 紅，張 宇，倪國華，趙 龍，陳 容

心肌梗死后可發生代償性的心室重構,心肌細胞凋亡可導致左心室舒張功能障礙,其貫穿于心肌梗死后心室肥大及心力衰竭的發展過程[1]。近年來有研究發現，他汀類藥物有改善心力衰竭及逆轉心室重構的作用,可誘導血管平滑肌細胞凋亡[2]。本研究旨在探討普伐他汀與阿托伐他汀預先干預對異丙腎上腺素急性損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響及對凋亡相關基因Bcl-2和Bax表達的影響。

1　材料與方法

1.1分組選取體質量為(200±20) g的 140只雌性普通級SD大鼠,適應性喂養2 d后按照隨機數字表分為6組：28只采用0.9%氯化鈉溶液灌胃(ISO組)，24只按30 mg/kg給予阿托伐他汀灌胃(L30組)，24只按10 mg/kg給予阿托伐他汀灌胃(L10組)，24只按120 mg/kg給予普伐他汀灌胃(P120組)，24只按40 mg/kg給予普伐他汀灌胃(P40組)，16只給予0.9%氯化鈉溶液灌胃(對照組)。

1.2方法每組每只大鼠每日灌胃1次，3 d后，對前5組大鼠分別皮下注射異丙腎上腺素300 mg/kg，對照組大鼠皮下注射0.9%氯化鈉溶液，分別于注射6 h和72 h時在每組大鼠中取8只進行血流動力學監測,同時檢測其Bcl-2和Bax的表達。

1.3血流動力學指標測定按3 ml/kg的標準腹腔注射0.3%水合氯醛溶液進行麻醉，將大鼠取仰臥位并適當固定，剪毛并對右頸部術區進行常規消毒。在術區作一大小合適的切口,分離頸總動脈并置管,連接生理記錄儀,記錄血流動力學各項指標。

1.4心肌組織學檢查仔細記錄壓力曲線，然后將大鼠心臟取出并洗凈，稱量濾紙吸干后的左室質量(LVW)，以左室質量指數 (LVWI)作為左心室重塑指標。

1.5免疫組化測定采用甲醛溶液常規固定左室心肌并進行連續石蠟切片，脫蠟,至水,封閉內源性過氧化物酶，采用抗原熱修復,然后滴加按1∶100稀釋的一抗工作液(Santa Cruz Biotechnology，美國)，將其置于濕盒內并放置在4 ℃冰箱過夜，PV-6001工作液在25 ℃下孵育，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，復染，脫水，透明后封片[3]。采用400倍的光鏡觀察，結果判斷標準:細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。隨機選擇5個陽性表達最強區的高倍視野計數陽性細胞總數和細胞總數,陽性表達率=陽性細胞數/細胞總數×100%，并求其平均值。

2　結果

2.1造模情況大鼠注射異丙腎上腺素后共死亡37只(28.9%),其中27只在第1天內死于急性左心力衰竭(ISO組10只,阿托伐他汀組7只，普伐他汀組10只),在解剖時發現雙側肺淤血伴或不伴有胸腔積液,另外10只于第2天死亡(5組各2只),對照組均未死亡。

2.2心肌重塑指標的改變與對照組比較，在注射異丙腎上腺素6 h和72 h時，其他5組大鼠體質量均減少，差異有統計學意義(P<0.05)；在72 h時，ISO組、P120組及P40組的LVW和LVWI與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1Changes of weigth and cardiac remodeling indexes after the statins intervention in the rats which isoproterenol-induced acute injury

組別只數體質量(g)6h　　　72hLVW(mg)6h　　　72hLVWI(mg/g)6h　　　72h對照組8211±11　209±13　462±26461±42　22±02　23±01　ISO組8200±11?190±13?480±27550±61?24±02　29±03?L30組8202±11?192±10?470±47514±68　23±01　24±03　L10組8200±13?194±10?470±48513±46　24±02?24±02　P120組8202±12?190±8?469±45540±30?24±02?29±02?P40組8196±13　186±14?462±42550±82?23±01?30±02?F值4346111636685293175P值<005<005>005<005<005<005

注：與對照組比較，*P<0.05；LVW=左室質量，LVWI=左室質量指數

2.3血流動力學比較與對照組比較，無論在注射異丙腎上腺素后6 h時還是72 h時，其他5組大鼠心率均加快，主動脈平均壓及左室內壓變化速率(dp/dtmax)均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.4Bax和Bcl-2表達的比較與對照組比較，在注射異丙腎上腺素12 h時，其他5組Bcl-2表達增高；在注射異丙腎上腺素后6 h及72 h時，其他5組大鼠Bax表達均增高，差異有統計學意義(P<0.05)；在72 h時，L10組、P120組和P40組Bax/Bcl-2較對照組增高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3Changes of Bax,Bcl-2 expression after statins intervention in the rats which isoproterenol-induced acute injury

組別只數Bcl-2(%)6h　　　72hBax(%)6h　　　72hBax/Bcl-26h　　　72h對照組821±920±11　11±9　12±9　065±039070±039　ISO組830±941±9?39±15?57±23?129±088149±070　L30組828±944±15?27±12?48±15?100±039120±051　L10組834±1140±16?36±16?51±13?140±048160±076?P120組829±1137±20?24±10?53±19?121±076169±065?P40組831±1040±16?31±10?54±16?112±048159±064?F值241962146922932101221P值>005<005<005<005>005<005

注：與對照組比較，*P<0.05

表2　他汀類藥物干預對異丙腎上腺素急性損傷大鼠血流動力學的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；dp/dtmax=左室內壓變化速率

3　討論

研究證實，他汀類藥物對血管平滑肌細胞有誘導凋亡的作用，近年有學者研究發現，他汀類藥物能提高血管內皮功能，促進血管內皮細胞釋放氧化亞氮，增強冠狀動脈對二氧化氮(NO2)依賴的血管舒張及調節功能[4]。也有研究結果顯示，他汀類藥物有明顯的抗血栓形成作用，除此以外，還有顯著的抗炎作用[5]。Tanaka等[6]學者觀察到阿托伐他汀對蛋白激酶C抑制劑誘導培養的大鼠心肌細胞凋亡具有明顯的阻斷作用。Ogata等[7]在比較普伐他汀與氟伐他汀對培養鼠心肌細胞增殖影響的實驗研究中發現，普伐他汀對大鼠心肌細胞的誘導凋亡作用不存在明顯的時間及劑量依賴性，而氟伐他汀與普伐他汀不同，存在明顯的時間及劑量依賴性。國外有學者報道，長期服用他汀類藥物可減少心肌肥厚和纖維化，可明顯改善心功能[8]。Hasegawa等[9]觀察到對長期喂飼高鹽膳食的Dhal鹽敏感大鼠西采用立伐他汀灌胃，能顯著減輕大鼠心室肥大、心肌纖維化，同時，還可顯著減少白介素1等各種炎性遞質的表達，保護心肌，從而避免或延緩心力衰竭的發生和發展。上述各學者研究結果各異，提示他汀類藥物作用于心肌細胞，對其凋亡的作用及影響頗為復雜[10]。

從本研究結果可以看出，在ISO組、L30組、L10組、P120組、P40組大鼠注射異丙腎上腺素6 h后，較對照組大鼠心率明顯增加，而主動脈平均壓較對照組均降低。引起這一結果的原因可能為短時間內經皮下大量注射異丙腎上腺素使心臟過度興奮，四肢靜脈血管擴張明顯，大量血液滯留在外周循環血管，靜脈回心血量減少，引起心輸出量減少。但在注射異丙腎上腺素72 h后，注射異丙腎上腺素的各組大鼠與對照組比較，心率仍然加快，主動脈平均壓較6 h時有所回升，但相比對照組而言，仍然降低，但均無統計學意義。在注射異丙腎上腺素后6 h和72 h時，各組體質量較對照組均明顯減輕；72 h時ISO組、P120組及P40組與對照組比較，LVW和LVWI均明顯增加。而L30組與L10組LVW和LVWI較對照組而言無明顯增加。與對照組比較，其與5組在注射異丙腎上腺素6 h后，Bax表達明顯增高，在72 h后Bax表達進一步增高，L10組、P120組及P40組Bax/Bcl-2較對照組明顯增高。

1宋潔,牛凡,王偉，等.普伐他汀與阿托伐他汀對大鼠心梗后胞外基質重構及基質金屬蛋白酶的影響[J].廣東藥學院學報,2007,23(6):673-675,678.

2張巍,趙明,王小鳳，等.大劑量阿托伐他汀對急性心肌梗死行急診PCI患者心肌再灌注損傷的影響[J].現代預防醫學,2011,38(21):4545-4547.

3吳志勇,漆紅梅,盛國太，等.氟伐他汀對心肌梗死后大鼠心肌細胞Fas蛋白表達及心室重塑的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(13):2487-2489.

4Sanguigni V,Pignatelli P,Lenti L,et al.Short-term treatment with atorvastat in reduces platelet CD40 ligand and thrombin generation in hyper cholesterolemic patients[J].Circulation,2005,111(4):412-419.

5周平,李法琦,張彬，等.辛伐他汀對高脂血癥大鼠心肌細胞內質網應激相關凋亡的影響[J].中國老年學雜志,2010,30(11):1545-1548.

6Tanaka K,Honda M,Takabatake T.Anti-apoptotic effect of atorvastatin,a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor,on cardiac myocytes through protein kinase C activation[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2004,31(5/6):360-364.

7Ogata Y,Takahashi M,Takeuchi K,et al.Fluvastatin induces apoptosis in rat neonatal cardiac myocytes:a possible mechanism of statin-attenuated cardiac hypertrophy[J].J Cardiovasc Pharmacol,2002,40(6):907-915.

8Erl W,Hristov M,Neureuter M,et al.HMG-CoA reductase inhibitors induce apoptosis in neointima-derived vascular smooth muscle cells[J].Atherosclerosis,2003,169(2):251-258.

9Hasegawa H,Yamamoto R,Takano H,et al.3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors prevent the development of cardiac hypertrophy and heart failure in rats[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(8):953-960.

10陳海榮.阿托伐他汀對急性心肌梗死患者血清高敏C-反應蛋白的影響[J].現代預防醫學,2011,38(18):3814-3815.