光動(dòng)力療法對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用研究

侯國(guó)芳，劉 艷，張霄蓓，劉晶晶，張 晟，張 瑾

1997年John Dick等人首次提出急性髓性白血病的發(fā)生、發(fā)展是由于一些具有自我更新、多系分化以及有成瘤能力的細(xì)胞所造成的，并將其命名為干細(xì)胞(CSCs)[1]。隨后，2003年Al-Hajj等[2]采用CD44+CD24-/lowlin-表面標(biāo)記分子分離出乳腺癌干細(xì)胞。鑒于腫瘤干細(xì)胞特殊的地位，其治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，癌癥的治療手段呈現(xiàn)多樣化和規(guī)范化的趨勢(shì)。在手術(shù)、化療、放療為主要治療手段的大背景下，光動(dòng)力療法(PDT)近年逐漸進(jìn)入人們的視野，其突出優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在無(wú)創(chuàng)性消滅局部腫瘤病灶，不良反應(yīng)小，可重復(fù)性高，但其對(duì)腫瘤干細(xì)胞是否具有抑制作用，尚未可知。基于此目的，本研究采用PDT作用于MCF-7乳腺癌干細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)生長(zhǎng)濃度抑制曲線和分析細(xì)胞凋亡圖形，探索PDT對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象人MCF-7乳腺癌細(xì)胞系為天津市腫瘤醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2試劑光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)購(gòu)于上海先輝醫(yī)藥科技有限公司。RPMI1640、胎牛血清(FCS)、Hank′s液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶、B27、DMEM購(gòu)于GIBCO公司；分選熒光抗體購(gòu)于SANTA CRUZ生物科技公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KeyGEN公司；胰島素購(gòu)于sigma公司；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)于Reprotech公司。其他試劑均由天津市腫瘤醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器37 ℃自動(dòng)CO2恒溫培養(yǎng)箱；無(wú)菌超凈臺(tái)；He-Ne激光器；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、流式細(xì)胞儀等儀器由天津市腫瘤醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)及流式方法分選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞將MCF-7細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FCS的RPMI1640。1～2 d換液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行傳代，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度孵化箱進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)MCF-7細(xì)胞，0.25%胰酶消化。終止消化后，1 000 r/m，5 min離心，離心半徑為15 cm,Hank′s液沖洗2遍。用Hank′s液重懸后吹成單細(xì)胞懸液，分裝于5個(gè)流式管，采用CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC抗體選取表面標(biāo)記為CD44+CD24-/lowESA+細(xì)胞。分選出的腫瘤干細(xì)胞采用含有EGF 20 μg/L、bFGF 10 μg/L、胰島素5 mg/L和B27(1∶50)的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.4.2MTT試驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)MCF-7細(xì)胞，0.25%胰酶消化，終止消化后收集細(xì)胞。同時(shí)收集經(jīng)過(guò)流式篩選的表型為CD44+CD24-/lowESA+MCF-7乳腺癌干細(xì)胞。二者分別分為4組，即空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組和PDT組。空白對(duì)照組不經(jīng)過(guò)任何處理，單純照射組僅采用激光照射，光照強(qiáng)度為5 J/cm2。單純光敏劑組僅加入濃度為40 μg/ml的光敏劑避光孵育2 h。而PDT組加入濃度為40 μg/ml的光敏劑避光孵育2 h，PBS沖洗后分別加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，再采用光照強(qiáng)度為5 J/cm2進(jìn)行照射。照射波長(zhǎng)為632.8 nm，激光功率密度為10 mW/ cm2，照射時(shí)間為5 min。

PDT整體過(guò)程均需避光操作。HMME孵育液采用DMEM液配制成所需濃度。MTT設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔，邊緣空用無(wú)菌PBS填充。將分選后的MCF-7乳腺癌干細(xì)胞置于96孔板中，經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)處理后孵育24 h。每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37 ℃，5%CO2飽和濕度孵化箱繼續(xù)孵育4 h。將上清液離心去除，每孔二甲基亞砜(DMSO)150 μl重懸，搖床上震蕩10 min，酶聯(lián)免疫吸附儀上檢測(cè)各孔的光吸收值(OD值)，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。試驗(yàn)重復(fù)3次。MCF-7乳腺癌細(xì)胞處理方式近似，在去除MTT溶液時(shí)不需要離心，直接吸除上清即可。

1.4.3細(xì)胞凋亡按照上述過(guò)程對(duì)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后置于35 mm培養(yǎng)皿中，分為空白對(duì)照組、單純光照組、單純光敏劑組和PDT組。空白對(duì)照組加入0.5%DMSO。單純照射組僅采用激光照射，光照強(qiáng)度為5 J/cm2。單純光敏劑組僅加入濃度為40 μg/ml的光敏劑避光孵育2 h。PDT組加入40 μg/ml光敏劑避光孵育2 h。PBS沖洗后加入新鮮干細(xì)胞培養(yǎng)液，置于5.0 J/cm2能量密度下進(jìn)行照射。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)處理后孵育24 h，收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和propidium iodide 各5 μl，室溫、避光條件下孵育15 min后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1MCF-7乳腺癌干細(xì)胞比例試驗(yàn)通過(guò)流式分選得到CD44+CD24-/lowESA+表型MCF-7乳腺癌干細(xì)胞所含比例為(1.2±0.4)%(見(jiàn)圖1)。

圖1　MCF-7乳腺癌干細(xì)胞比例

2.2MTT試驗(yàn)結(jié)果空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組及PDT組MCF-7乳腺癌干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PDT組較空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組及PDT組未分選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PDT組較空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空白對(duì)照組、單純照射組及PDT組MCF-7乳腺癌干細(xì)胞與未分選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞采用生長(zhǎng)抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組與PDT組MCF-7乳腺癌干細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PDT組較空白對(duì)照組、單純照射組、單純光敏劑組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2、圖2)。

注A=空白對(duì)照組，B=單純光照組，C=單純光敏劑組，D=PDT組

圖2不同治療方法對(duì)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞凋亡的影響

Figure2Apoptosis of MCF-7 breast cancer stem cells with different treatment

Table1Inhibitory effects of photodynamic therapy on unsorted MCF-7 breast cancer cells and breast cancer stem cells

組別MCF-7乳腺癌干細(xì)胞未分選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞t值P值空白對(duì)照組　40±05?　103±25?　4275　0013單純照射組　97±04?　198±14?11667<0001單純光敏劑組　75±05?　150±50?　2587　0061PDT組469±04　512±11　64640003F值594361187P值<0001<0001

注：與PDT組比較，*P<0.05

Table2Comparison of apoptosis of MCF-7 breast cancer stem cells with different treatment

組別凋亡率空白對(duì)照組　135±009?　單純照射組　328±060?　單純光敏劑組　208±039?　PDT組1348±022　F值67682P值<0001

注：與PDT組比較，*P<0.05

3　討論

由于乳腺癌干細(xì)胞特殊的性質(zhì)，其對(duì)化療、放療、內(nèi)分泌治療均存在一定程度的耐受[3-5]。PDT最為近年來(lái)新興的一種無(wú)創(chuàng)性治療手段，其對(duì)乳腺癌干細(xì)胞是否具有作用報(bào)道較少。本研究選取乳腺癌干細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)生長(zhǎng)濃度抑制曲線和分析細(xì)胞凋亡圖形，檢測(cè)了光動(dòng)力的治療作用。

研究顯示無(wú)論是未分選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞還是分選出的腫瘤干細(xì)胞，不同處理組組間的抑制作用均具有差異，PDT組的抑制率均明顯高于其他幾組。但是相同光敏劑濃度和光照強(qiáng)度下，未分選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞受抑制更明顯。該結(jié)論同之前的研究結(jié)果相似，乳腺癌干細(xì)胞對(duì)多種治療方式均存在耐受現(xiàn)象[3-5]。HMME作為我國(guó)研制的第二代光敏劑，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了其對(duì)惡性消化道腫瘤的治療作用[6]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞也具有抑制作用[7-8]。從本研究結(jié)果來(lái)看，雖然HMME PDT體現(xiàn)了對(duì)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用，但仍然不可避免的存在耐受。研究人員認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療的耐受與ABCG2將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞有密切關(guān)系[9]。光敏劑作為一種化學(xué)物質(zhì)，是否ABCG2也將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞從而影響其作用效果？研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞系A(chǔ)BCG2表達(dá)影響了金絲桃素介導(dǎo)的光動(dòng)力效應(yīng)的發(fā)揮[10]。同樣，肺癌細(xì)胞也存在類似的現(xiàn)象[11]。此外，皮膚角質(zhì)細(xì)胞在加入ABCG2抑制劑后，其對(duì)光動(dòng)力治療的敏感性顯著提高[12]。這些研究結(jié)果提示我們?nèi)橄侔└杉?xì)胞對(duì)光動(dòng)力治療的耐受性也可能與ABCG2表達(dá)有關(guān)。因此今后的研究可以聯(lián)合抑制ABCG2表達(dá)或作用的藥物，以期進(jìn)一步提高治療效果。

雖然光動(dòng)力治療對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用并未展現(xiàn)出絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，但是仍然顯示了一定的療效。其作用方式究竟是直接殺傷還是誘導(dǎo)凋亡？本研究認(rèn)為光動(dòng)力治療對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示光動(dòng)力治療組乳腺癌干細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。Liu等[7]選取犬乳腺癌細(xì)胞及光敏劑HMME作為研究對(duì)象，結(jié)果顯示光動(dòng)力治療以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡為主。此外，以其他物質(zhì)作為光敏劑的光動(dòng)力治療結(jié)果也支持該結(jié)果。但是否由caspase家族始動(dòng)凋亡過(guò)程，目前報(bào)道尚未達(dá)成一致。可能與選擇光敏劑種類不同或細(xì)胞定位不同有關(guān)[13-16]。因此，進(jìn)一步研究應(yīng)當(dāng)檢測(cè)光敏劑細(xì)胞定位及凋亡相關(guān)因子。

綜上所述，PDT對(duì)乳腺癌干細(xì)胞具有一定程度的抑制作用，但是仍然存在耐受。其抑制乳腺癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，但確切機(jī)制仍需進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)因子等來(lái)驗(yàn)證。耐受的原因可能與ABCG2高表達(dá)有關(guān)，可以聯(lián)合相關(guān)藥物以提高療效。

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