環氧化酶2 3′非翻譯區+8473T>C基因多態性及其與吸煙、幽門螺桿菌感染的交互作用對食管癌發病的影響研究

盧玉娟，張紅巖，代素梅，黎 杰，張 志

食管癌是危害人類生命和健康的嚴重疾病之一，在全世界范圍內的發病率和病死率均較高。雖然臨床上治療食管癌的技術不斷改善和提高，但是總體上的療效并不令人滿意。目前，食管癌的病因及發病機制尚不完全清楚。研究表明，飲食因素和環境因素是我國食管鱗癌的最主要危險因素，吸煙是重要的環境致癌因素，在食管癌的發生發展中起重要作用；近年來分子流行病學研究提示，基因多態性也是腫瘤個體易患因素[1-2]。

環氧化酶2(COX-2)是花生四烯酸代謝的關鍵酶，COX-2的高表達與包括食管癌在內的多種腫瘤的發生密切相關[3-6]。機體在正常情況下，COX-2的表達是被精確控制的，而在惡性轉化細胞COX-2的表達調控能力發生了改變；COX-2基因轉錄調節缺失及其后發生的mRNA降解失調均可導致COX-2的表達增高[7-8]，進而增強腫瘤生長及侵襲轉移能力。研究發現，COX-2 3′非翻譯區(UTR)+8473T>C基因多態性與乳腺癌、非小細胞肺癌的發病風險增加密切相關[9-10]，已知幽門螺桿菌在食管癌的發生發展中起重要作用，且幽門螺桿菌感染可誘導COX-2表達。本研究采用病例對照研究方法探討COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性及其與吸煙、幽門螺桿菌感染的交互作用對食管癌發病的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2006年1月—2011年1月在唐山市工人醫院進行治療的食管癌患者119例為病例組，均經組織病理學檢查確診，術前未進行放化療；按照2∶1比例選擇同期體檢正常者238例為對照組，均無腫瘤病史和體征。按照美國腫瘤聯合會(AJCC)2002年制定的腫瘤TNM分期標準，病例組患者中Ⅰ期20例、Ⅱ期37例、Ⅲ期55例、Ⅳ期7例。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性的基因分型采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術(PCR-RFLP)進行。具體如下：擴增3′UTR含8473C/T多態性位點的引物為u8473F 5′-GTT TGA AAT TTT AAA GTA CTT TTG AT-3′和u8473R 5′-GAC ATG AAA TTA CTG GTA ATG TCT-3′，產物長度為110 bp。限制性核酸內切酶 BclⅠ(New England Biolabs，MA)用于 8473C→T多態性位點的基因型分析。酶切在10 μl反應體系中進行，其中含8 μl 聚合酶鏈反應(PCR)產物、1×反應緩沖液和3 U相應核酸內切酶。將反應混合液置于37 ℃水浴4 h，限制性酶切產物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，判斷其基因型。在8473C→T多態性位點上游第2個堿基處引入錯配堿基A后，8473C等位基因產生一個BclⅠ酶切位點，而8473T等位基因不含BclⅠ酶切位點，因此TT基因型產生一個110 bp片段，CC基因型產生88 bp和22 bp共2個片段，而CT基因型產生110 bp、88 bp和22 bp共3個片段。

1.2.2 幽門螺桿菌感染狀態 參考文獻[11]中的方法，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測兩組受試者血清幽門螺桿菌抗體IgG和IgA水平，以IgA或IgG水平>1.0 U判定為幽門螺桿菌抗體陽性，表示有幽門螺桿菌感染。

2 結果

2.1 一般資料 兩組受試者的性別構成、平均年齡、吸煙率及血清幽門螺桿菌抗體陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 兩組一般資料比較

注：*為t值

2.2 COX-2 3′UTR+8473T>C基因型分布 兩組受試者TT、TC、CC基因型頻率比較，除TT基因型外，差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)；對照組COX-2 3′UTR+8473C等位基因頻率為0.134，病例組為0.210，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。非條件Logistic回歸分析顯示，病例組攜帶1個C等位基因、2個C等位基因、TC+CC基因型者的食管癌發病風險分別為對照組的1.60倍〔95%CI(0.91，2.83)，P=0.08〕、3.29倍〔95%CI(1.10，11.62)，P=0.03〕、1.76倍〔95%CI(1.12，2.93)，P=0.02〕。

表2 兩組COX-2 3′UTR+8473T>C基因型分布〔n(%)〕

Table2 Distribution of COX-2 3′UTR+8473T>C genotype between the two groups

組別例數TTTCCC對照組238179(75 2)54(22 7)5(2 1)病例組119 76(63 9) 36(30 1)7(6 0)χ2值5 002 413 49P值0 030 120 06

2.3 COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性與吸煙的交互作用 在吸煙人群中，病例組攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者食管癌發病風險是對照組的2.11倍，差異有統計學意義(P<0.05)；在非吸煙人群中，病例組攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者食管癌發病風險是對照組的1.34倍，但差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

表3 COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性與吸煙的交互作用(例)

Table3 Crosscorrelation of COX-2 3′UTR+8473T>C polymorphisms and smoking

組別例數吸煙 TT TC+CC不吸煙 TT TC+CC對照組238108367123病例組119 41 283515OR(95%CI)2 11(1 08，3 96)1 34(0 59，3 01)P值0 020 47

2.4 COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性與幽門螺桿菌感染的交互作用 在血清幽門螺桿菌抗體陽性人群中，病例組攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者食管癌發病風險是對照組的3.98倍，差異有統計學意義(P<0.001)；在血清幽門螺桿菌抗體陰性人群中，病例組攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者食管癌發病風險是對照組的0.86倍，但差異無統計學意義(P>0.05，見表4)。

表4 COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性與幽門螺桿菌感染的交互作用(例)

Table4 Crosscorrelation of COX-2 3′UTR+8473T>C polymorphisms and Helicobacter pylori infection

組別例數幽門螺桿菌抗體陽性 TT TC+CC幽門螺桿菌抗體陰性 TT TC+CC對照組238101197840病例組119 34 254218OR(95%CI)3 98(1 85，8 46)0 86(0 39，1 80)P值<0 0010 60

3 討論

在人類基因組中，mRNA的轉化是一個被高度調控的過程，在哺乳動物基因表達過程中起關鍵作用。人類COX-2 3′UTR含有22個AUUUA重復序列，可能通過改變多聚腺苷酸位點改變mRNA的長度，從而影響mRNA的降解。對許多哺乳動物COX-2 mRNA進行的分析表明，COX-2的AU元件(ARE)可以被調控而影響COX-2的表達[8，12-13]。ARE調控基因表達是通過和反式作用的RNA結合蛋白相互作用而實現的。COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性可能通過改變mRNA的降解而影響mRNA及其相應蛋白的表達水平，最終影響包括腫瘤在內的復雜疾病的發病進程。

本研究對COX-2基因多態性與食管癌發病風險的關系進行研究，發現攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者食管癌發病風險明顯增加，與Langsenlehner等[10]報道其增加乳腺癌發生風險和Campa等[14]報道其增加非小細胞肺癌一致。但Hu等[15]研究結果顯示COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性可降低肺癌發生風險[15]，提示腫瘤發生發展中除遺傳因素外，其他因素同樣發揮著重要作用。因此，本研究對COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性與吸煙、幽門螺桿菌感染的交互作用對食管癌發病的影響做了進一步分析。

吸煙是公認的致癌物，特別是肺癌，近年來關于吸煙與食管癌發病風險的研究也有報道。Hashibe等[16]對包括1 000例食管癌患者的人群進行研究，發現吸煙個體罹患食管癌的風險是不吸煙者的7.41倍，本研究結果與之基本一致，提示攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者可能更容易被吸煙而誘導COX-2 mRNA的表達，對吸煙所引起的損傷更敏感。

幽門螺桿菌感染是食管癌重要的危險因素之一，目前認為幽門螺桿菌感染引發炎癥反應主要與COX-2有關[17]。研究表明，幽門螺桿菌可誘導白介素(IL)-8、IL-1 和核因子(NF)-κB等細胞因子表達，而這些細胞因子可通過激活細胞內多種細胞調節因子而增加COX-2 mRNA的表達[18-19]。本研究結果顯示，在幽門螺桿菌感染人群中，攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者食管癌發病風險明顯增加，提示攜帶COX-2 3′UTR+8473C等位基因者可能更容易被幽門螺桿菌感染而誘導COX-2 mRNA的表達，從而易患食管癌。

總之，COX-2 3′UTR+8473T>C基因多態性是影響食管癌發病的重要的遺傳易患因素，可增加食管癌發病風險，且與吸煙、幽門螺桿菌感染存在交互作用。但本研究樣本量較小，由于條件有限并未對其他環境因素進行綜合分析，存在一定的混雜因素，仍需進一步深入研究。

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