胎鼠神經干細胞移植對大鼠脊髓損傷后神經元特異性烯醇化酶和皮質體感誘發電位的影響研究

孔令勝，靳 峰，郭 強，張 浩，胡亞偉

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)對機體造成災難性的后果，表現為損傷節段平面以下感覺、運動功能完全喪失和大小便失禁。由于缺乏有效的治療方法，世界各國均把SCI的臨床治療作為一項難題及科研重點。神經干細胞(NSCs)具有自我增殖能力和多向分化潛能，在神經損傷修復方面有著良好的應用前景[1-3]，NSCs移植已成為治療SCI新的研究熱點[4-6]，但對移植后神經元特異性烯醇化酶(NSE)和皮質體感誘發電位(CSEP)的變化研究少。本研究旨在動態觀察NSCs移植對大鼠SCI后NSE和CSEP的影響，從而為NSCs移植治療SCI提供理論和物質基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年健康雄性清潔級SD大鼠40只，體質量(250±20)g(徐州醫學院實驗動物中心)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)抗體(Sigma)，基礎細胞培養基(DMEM/F12，1∶1,Hyclone)，B27復合物(Gibco)，成纖維細胞生長因子(bFGF)，表皮樣生長因子(EGF，Invitrogen)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，多聚賴氨酸(Sigma)，巢蛋白(Nestin)抗體(Sigma)，NSE抗體(Sigma)，二氨基聯苯胺(DAB)液體(Boster)，二步法免疫組化試劑盒(Zymed)，其他試劑均為國產分析純或化學純。自行研制的電控SCI自動打擊裝置。NDI-200海神號神經電檢診儀(上海海軍醫學研究所)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎大鼠NSCs的分離培養和鑒定以及移植細胞的制備分別參見參考文獻[7]和[8]進行。

1.2.2 大鼠SCI模型的制作及分組 SD大鼠40只按隨機數字表法分為Brdu+NSCs組、NSCs組、SCI組和假手術組(Sham組)，每組10只。Sham組僅做椎板切開術。SCI組：戊巴比妥鈉溶液(0.5 ml/100 g)腹腔麻醉后，將大鼠固定于立體定位儀上，以第13肋為標志沿后正中線切開，咬除T13～L1椎板暴露脊髓，固定T12、L2椎體，以T13棘突相對應的脊髓后正中血管為中心用電磁程控鐵棒下落打擊裝置損傷脊髓，打擊力量為10×2.5 g·cm。NSCs組：神經干細胞植入損傷脊髓組。Brdu+NSCs組：Brdu標記的神經干細胞移植組。大鼠死亡及時復制模型補充。

1.2.3 脊髓內NSCs移植 造模成功后即刻參考Miura等[9]方法行NSCs移植。大鼠麻醉后固定于立體定位儀上，原切口進入，在平T13棘突處硬脊膜背側正中血管旁1 mm處輕輕挑開硬脊膜成一縱行小口，用漢密爾頓微量注射器，向頭側呈45°角進針，深度1.5 mm，將細胞濃度為2×105/μl的NSCs懸液5 μl、0.9%氯化鈉溶液5 μl分別注入NSCs組、SCI組，10 min內完成注射，保留5 min后退出。

1.2.4 CSEP檢查 參照人類CSEP檢測和記錄的方法，在室溫25 ℃的實驗室中，大鼠腹腔麻醉，刺激電極置于內踝脛后神經上，陽極置遠心端，小腿部皮下接地，記錄電極置于顱表相當于人類的中央區(Cz)，參考電極置于前額區(FPz)，電極阻抗<5 kΩ，帶通范圍30～1 500 Hz，分析時間50 ms，刺激頻率3 Hz，刺激強度為引起趾的輕微收縮，疊加500 次，每次檢查至少重復2次，以求獲得較好的重復性[10]。CSEP檢測結束行組織病理學取材觀察。

1.2.5 蘇木素-伊紅(HE)染色、Brdu及NSE免疫組織化學染色 NSCs移植后第1、3、7、14、28 天取材，大鼠在深麻醉下，以0.4%多聚甲醛行心臟灌流固定，取損傷段脊髓，在30%蔗糖磷酸鹽緩沖液中沉底后，用冷凍切片機自SCI處做連續橫切片，片厚30 μm，切片收集于裝有0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液的細胞培養板的兩孔中，依次留片，每孔中留片15張。行常規HE染色及按二步法免疫組織化學試劑盒操作步驟進行Brdu、NSE免疫化學染色。

1.2.6 圖像分析 采用LEICA QWin圖像處理與分析系統進行分析。在200倍鏡下計數脊髓沿中央導水管橫線以前NSE陽性細胞數；在400倍鏡下選擇不重疊的5個視野計算NSE陽性細胞灰度。

2 結果

2.1 皮質體感誘發電位-P波(CSEP-P)檢測結果 Sham組大鼠在各時間點CSEP-P潛伏期為17～18 ms，經比較左右兩下肢測量的結果差異無統計學意義(P>0.05)，統一選擇右下肢的測量結果。4組間各時間點CSEP-P潛伏期比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。Sham組和SCI組各時間點間CSEP-P潛伏期比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；而Brdu+NSCs組和NSCs組各時間點間比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。其中SCI組、NSCs組和Brdu+NSCs組各時間點CSEP-P潛伏期與Sham組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；NSCs組和Brdu+NSCs組除第1天外余各時間點與SCI組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；Brdu+NSCs組與NSCs組比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。排除了Brdu對實驗結果的影響。

2.2 移植NSCs在脊髓內的存活及遷移 Brdu陽性細胞呈時間依賴性變化趨勢[8]：Brdu陽性細胞在移植術后第7天可檢測到，為棕黃色核標記的小圓形細胞，沿移植穿刺針道呈串珠狀排列，Brdu陽性細胞平均每高倍鏡視野陽性細胞數為(7.3±1.7)個；第14天移植細胞在臨近損傷區逐漸增多，陽性細胞數為(18.4±3.0)個(t=10.245，P<0.01)，且向移植針道周圍遷移可達1.1 cm；移植術后第28天陽性細胞逐漸減少并消失，其余各組無陽性細胞。

2.3 脊髓HE染色的光鏡觀察 Sham組大鼠脊髓灰質運動神經元、膠質細胞的細胞輪廓清楚，胞核清晰，部分細胞可見核仁，呈鳥眼樣。SCI組損傷后第1天，脊髓背側可見缺損區域，灰質結構破壞，白質中可見有腫脹的軸突和大量的空泡。SCI后第3天及第7天灰質和白質中部分細胞形態改變，突起減少，膠質細胞增生。SCI后第14～28天，損傷范圍更為明確，脊髓變細并有空洞形成，膠質細胞瘢痕形成。Brdu+NSCs組移植后第1天，脊髓中可見出血灶，灰質結構破壞，尼氏體減少，細胞體積減小；第3天及第7天損傷達高峰，殘留細胞數量相對較多。SCI后第14天及第28天，損傷部位殘留細胞形態大致正常，尼氏體增加。Brdu+NSCs組與NSCs組之間比較病理學改變無明顯差異(見圖1、2)。

2.4 NSE免疫組織化學染色結果分析 NSE主要存在于神經元的胞質中。4組間各時間點NSE 免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。Sham組各時間點間NSE 免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而SCI組、Brdu+NSCs組和NSCs組各時間點間比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。其中SCI組、NSCs組和Brdu+NSCs組各時間點NSE 免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數與Sham組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；NSCs組和Brdu+NSCs組除第1天外余各時間點與SCI組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；Brdu+NSCs組與NSCs組比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2、表3)。NSE免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數與CSEP-P潛伏期均呈負相關(r=-0.937，P<0.001；r=-0.956，P<0.001)。

表1 4組各時間點CSEP-P潛伏期比較Table 1 Comparison of the latency of CSEP-P wave at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

圖1 SCI組移植后第7天(A)與移植后第28天(B)的HE染色(A：×100，B：×40)Figure 1 HE staining 7 d(A) and 28 d(B)after transplantation in SCI group

表2 4組各時間點NSE 免疫陽性細胞灰度值比較Figure 2 Comparison of the grey level of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

表3 4組各時間點NSE免疫陽性細胞數比較Table 3 Comparison of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

3 討論

中樞神經再生問題一直是神經科學界在理論研究和臨床實踐上感到十分困惑且尚未找到有效治療方法的重大難題。因而外傷導致中樞神經的損害尤為嚴重，諸如腦皮質功能受損或消失、SCI所致的癱瘓等[11-13]。NSCs是中樞神經系統中保持分裂和分化潛能的細胞，NSCs移植已成為人們探索治療神經系統損傷的新途徑，有研究報道，NSCs移植能在挫傷腦組織存活、遷移，并促進宿主神經元存活、局部軸突再生和改善腦挫傷大鼠神經功能[14]。Brdu是胸腺苷類似物，可通過堿基互補配對的原則整合到處于S期的原始干細胞雙鏈DNA中，在半保留復制過程中逐漸消減。本研究將Brdu標記的NSCs移植到大鼠SCI區，并于移植后第7天、第14天檢測到逐漸增多的Brdu陽性細胞，移植細胞沿移植穿刺針道排列并發生了遷移，以上結果表明移植的NSCs可以存活于SCI區并向SCI區域發生了遷移，從而為下一步深入研究奠定了基礎。

CSEP是連續刺激外周感覺神經纖維在中樞神經系統誘發的綜合電位活動，其變化可反映出脊髓神經功能受損的程度，能夠客觀、量化和敏感地評價感覺功能障礙[15]。研究證實，脊髓后索和后外側索是CSEP傳導的主要通路。由于脊髓前后索相鄰，又為同一軟脊膜包繞，故CSEP也能間接反映前索情況，說明CSEP與后肢運動功能之間存在一定聯系。CSEP的波幅變化個體變異非常大，而潛伏期變化比較恒定，且與損傷程度及功能狀態的相關性也較大；潛伏期能夠反映神經纖維傳導速度，潛伏期延長說明神經纖維傳導阻滯，潛伏期縮短說明神經纖維傳導速度增快，脊髓神經傳導功能恢復[16]，故本研究只檢測了潛伏期的變化。結果表明，Brdu+NSCs組與NSCs組CSEP潛伏期除移植后第1天外其余各時間點均較SCI組顯著縮短，提示NSCs移植能夠促進SCI后神經傳導功能的恢復，可能的作用機制是NSCs移植入損傷脊髓后能從細胞結構上與宿主融合，遷移分化成特定的神經元，分泌細胞因子，一方面上調與軸索生長相關的基因，促進受損的神經元軸索再生；另一方面，與其他的神經元建立突觸聯系，重建神經環路，達到SCI的功能性恢復。

烯醇化酶普遍存在于哺乳動物組織中，其同工酶以αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5種形式存在于細胞質中，γγ型特異性地存在于神經元和神經內分泌細胞中(線粒體內)，故命名為NSE[17]。NSE含量由高到低依次位于腦、脊髓、周圍神經節，一旦缺血或受損，神經元胞體和軸突的細胞膜完整性發生變化，使細胞內大量蛋白質(包括NSE)迅速進入細胞間隙，胞內的NSE減少，同時在腦脊液和血液內可以檢測到NSE。本研究觀察到SCI組損傷后NSE免疫陽性細胞灰度值和陽性細胞數明顯減少，第3天開始緩慢恢復，同時伴有CSEP-P潛伏期的緩慢縮短，提示NSE的表達不僅能反映脊髓神經損傷的程度，而且也參與了SCI后的修復過程，是脊髓感受傷害性反應的內源性保護劑，但這種自發的內源性的保護作用是有限度的。Brdu+NSCs組與NSCs組除移植后第1天外，各時間點NSE免疫陽性細胞灰度值均高于SCI組，陽性細胞數亦多于SCI組，HE染色亦觀察到移植后第28天損傷部位殘留細胞形態大致正常，尼氏體增加。相關分析表明，NSE免疫陽性細胞灰度值越高、陽性細胞數越多，SCI后CSEP-P潛伏期縮短越明顯，結果提示，NSCs移植能明顯上調SCI后NSE的表達，并能通過促進NSE的表達而縮短CSEP-P潛伏期，從而減輕SCI、保護神經功能，進而促進大鼠后肢神經功能障礙的恢復，具體的調控機制尚待進一步深入研究。

綜上所述，體外培養的NSCs移植到SCI區域后可存活、遷移，且能明顯上調SCI后NSE的表達，并能通過促進NSE的表達而縮短CSEP-P潛伏期，從而促進大鼠后肢功能障礙的恢復。但以上結果與Sham組相比仍有一定差距，表明單純NSCs并不能得到十分滿意的脊髓功能恢復，因而尋求多種方法的聯合運用治療SCI將是我們繼續研究的課題和努力的方向。

1 Bethea CL，Reddy AP，Pedersen D，et al.Expression profile of differentiating serotonin neurons derivel from rhesus embryonic stem cells and comparison to adult serotoin neurons[J].Gene Expr Patterns，2009，9(2)：94-108.

2 Chigr F，Rachidi F，Segura S，et al.Neurogenesis inhielial in the dorsal vagal complex by chronic immobilization stress in the adult rat[J].Neuroscience，2009，158(2)：524-536.

3 劉詩翔，王琳，胡靜，等.綠色熒光蛋白轉基因小鼠神經干細胞移植對海仁藻酸致SD大鼠小腦變性損害的實驗研究[J].疑難病雜志，2009，8(9)：517.

4 Saberi H，Moshayedi P，Aghayan HR，et al.Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation：an interim report on safety considerations and possible outcomes[J].Neurosci Lett，2008，443(1)：46-50.

5 Meletis K，Barnabé-Heider F，Carlén M，et al.Spinal cord injury reveals multilineage differentiation of ependymal cells[J].PLoS Biol，2008，6(7)：e182.

6 Carvalho KA，Vialle EN，Moreira GH，et al.Functional outcome of bone marrow stem cells〔CD45(+)/CD34(-)〕after cell therapy in chronic spinal cord injury in Wistar rats[J].Transplant Proc，2008，40(3)：845-846.

7 孔令勝，張軍臣，張冉，等.胚胎大鼠神經干細胞的分離培養及鑒定研究[J].濟寧醫學院學報，2009，32(2)：96-99.

8 孔令勝，聶冬麗，張軍臣，等.神經干細胞移植促進大鼠脊髓損傷后前角運動神經元存活及后肢運動功能恢復的實驗研究[J].實用醫學雜志，2009，25(20)：3402-3404.

9 Miura T，Tanaka S，Seichi A，et al.Partial functional recovery of paraplegic rat by adenovirus-mediated gene delivery of constitutively active MEK1[J].Exp Neurol，2000，166(1)：115-126.

10 賀斌，吳萍嘉，周暉，等.脛后神經體感誘發電位對脊髓病變的定位診斷[J].第二軍醫大學學報，1998，19(6)：560-562.

11 Xiao Q，Du Y，Wu W，et al.Bone morphogenetic proteins mediate cellular response and，together with Noggin，regulate astrocyte differentiation after spinal cord injury[J].Exp Neurol，2010，221(2)：253-366.

12 Wang D，Zhang JJ，Yang ZX.Treatment of spinal cord injury by transplanting neural stem cells with NgR gene silencing[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2010，22(1)：28-31.

13 Lee SH，Chung YN，Kim YH，et al.Effects of human neural sstem cell transplantation in spinal cord hemisection[J].Neurol Res，2009，31(9)：996-1002.

14 陳珊珊，段宇，但齊琴，等.神經干細胞移植對腦挫傷大鼠神經功能恢復神經元存活和軸突再生的影響[J].中華行為醫學與腦科學雜志，2010，19(8)：673-676.

15 Costa P，Bruno A，Bonzanino M，et al.Somatosensory and motorevoked potential monitoring during spine and spinal cord surgery[J].Spinal Cord，2007，45(1)：86-91.

16 侯為民，黃承光，周暉，等.體感誘發電位在椎管內占位顯微手術中的監測[J].醫師進修雜志，2003，26(6)：14-16.

17 Cao F，Yang XF，Liu WG，et al.Elevation of neuron-specific enolase and S-100beta peotein level in experimental acute spinal cord injury[J].J Clin Neurosci，2008，15(5)：541-544.