反相高效液相色譜法測定替硝唑氯化鈉注射液中乙二胺四乙酸二鈉含量

陸 瀅

(江蘇省鹽城市第一人民醫院，江蘇 鹽城 224000)

替硝唑氯化鈉注射液對大多數厭氧菌有較強抗菌作用，臨床用于各種厭氧菌感染，如敗血癥、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支氣管感染。但在臨床使用時，替硝唑氯化鈉注射液有時會出現渾濁現象。有研究表明，替硝唑氯化鈉注射液處方中添加乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)后可顯著提高輸液的穩定性，其原理為EDTA與輸液中微量的金屬離子形成螯合物后，阻止了金屬離子對藥物自身氧化的催化作用。因此在替硝唑氯化鈉注射液處方中添加一定量的EDTA作為螯合劑，可顯著改善輸液的配伍穩定性。但如人體大量攝入EDTA，它會與血液及骨骼中經過的鈣形成水溶性螯合物，被排除體外，引起低血鈣或骨鈣流失，因此有必要對EDTA的含量進行控制，雖然已有EDTA的檢測報道，但所用方法不能定量檢測。為確保用藥安全，筆者參照相關文獻建立了替硝唑氯化鈉注射液中EDTA的含量測定方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，Agilent-1200型色譜工作站(美國Agilent公司);BP211D型電子天平(德國賽多利斯公司);Seven Easy pH計(上海精密儀器科學儀器有限公司)。替硝唑氯化鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業有限公司，批號分別為 1121007，1120527，1120102，規格為 100 mL∶替硝唑 0．4 g與氯化鈉 0．9 g);乙腈(美國Tedia公司)為色譜純，乙二胺四乙鈉二鈉磷酸、10%四丁基氫氧化銨溶液，均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:乙腈-緩沖液(10%四丁基氫氧化銨溶液6 mL，加水稀釋至200 mL，以磷酸調節pH至6．5)-水(20∶20∶60);檢測波長:254 nm;流速:1．0 mL/min，柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。

2．2 溶液制備

精密稱取EDTA適量，加水使溶解并定量稀釋成0．5 g/L的EDTA溶液，精密吸取5 mL置50 mL容量瓶中，加1%硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，即得對照品溶液。精密量取替硝唑氯化鈉注射液適量(相當于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水適量使溶解，加1%硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。精密稱取不含EDTA的空白制劑適量(相當于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水適量使溶解，加1%硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，即得空白對照溶液。

2．3 方法學考察

系統適用性試驗:精密稱取EDTA空白對照溶液、供試品溶液及對照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明，EDTA峰的理論板數約為2 000，奧美拉唑鈉與EDTA的分離度良好，見圖1。

線性關系考察:精密吸取 0．5 g/L 的 EDTA 溶液 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，16．0 mL 分別置 50 mL 容量瓶中，加 1%硫酸銅溶液10 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，0．45 μm微孔濾膜濾過，分別精密量取續濾液20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖以EDTA進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程 Y=53 653．764 5 X-1 486．165 8，r=0．999 8。結果表明，EDTA進樣量在0．1～2．0 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

圖1 高效液相色譜圖

穩定性試驗:取同一批(批號為1121007)的供試品溶液，精密吸取20 μL，每間隔一定時間進樣，測定，以峰面積考察。結果的 RSD為0．93%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

精密度試驗:取同一批(批號為1121007)替硝唑氯化鈉注射液6份，依法平行測定其含量，結果EDTA的平均含量為每瓶4．43 mg，RSD為1．45%，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗:稱取3批(批號分別為1121007，1120527，1120102)已知含量的樣品，每批3份，精密稱定，分別加入對照品適量，按2．2項下方法制備供試品溶液，測定其含量，計算回收率，結果見表1。

檢測下限考察:取EDTA溶液(0．51 g/L)1 mL，置10 mL容量瓶中制成混合液[1]，取混合液依次稀釋至1 000倍時，信噪比[2](S/N)約為 10。檢測限質量濃度約為 0．51 μg/mL。

表1 EDTA加樣回收試驗結果(n=6)

2．4 樣品含量測定

精密量取本品適量(相當于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水適量，加1%的硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以 0．45 μm 的微孔濾膜濾過，精密量取 20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密稱取EDTA 25 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL置50 mL容量瓶中，加1%的硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，同法測定，按外標法以峰面積計算，結果批號分別為1121007，1120527，1120102的樣品EDTA含量分別為 4．43，4．41，4．61，4．71，4．57，4．51 mg/瓶。

3 討論

由于EDTA易與金屬離子絡合，在色譜柱中，EDTA和色譜柱不銹鋼表面會發生絡合，導致EDTA的相應值變低峰形嚴重拖尾。本法采用硫酸銅溶液，使EDTA和銅離子形成比較穩定的絡合物，可以避免EDTA和色譜柱不銹鋼表面發生作用，提高檢測靈敏度，改善峰形。研究表明，1%的硫酸銅溶液的用量為10 mL時，EDTA的峰形較好，故以此作為反應濃度。

在加硫酸銅溶液進行反應時溶液會發生渾濁，因此在反應完成后，用0．45 μm的微孔濾膜過濾，防止堵塞和污染色譜柱，同時也降低了對EDTA測定的干擾作用。采用本法測定替硝唑氯化鈉注射液中EDTA的含量，具有簡捷方便，結果準確，靈敏度高，色譜峰峰形好，分離度好的特點。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．中國醫藥科技出版社，2010:140，622，附錄ⅩD．

[2]張俊松，戚 燕，王曉利，等．注射用奧美拉唑中微量EDTA的檢查[J]．藥物分析雜志，2006，26(12):1 721-1 722．