柱前衍生高效液相色譜法測定門冬氨酸的含量

楊 穎，閻秀美，陳乃江

(1．江蘇省連云港市藥品檢驗所，江蘇 連云港 222000;2．江蘇德源藥業有限公司，江蘇 連云港 222000)

門冬氨酸又名 L-α-氨基丁二酸是氨基酸類藥物，常用于配制復方氨基酸類藥物，如門冬氨酸鳥氨酸注射液、門冬氨酸鎂鉀注射液等。藥典標準中，采用高氯酸電位滴定法測定其含量。在文獻[1-4]的基礎上，本試驗中建立了紫外衍生化試劑異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化測定門冬氨酸含量的方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

Aglient1260型高效液相色譜儀;BP211D型電子天平(Sartorius)。門冬氨酸對照品(中國藥品生物制品檢驗所，批號為140691-200401);乙腈為色譜純，磷酸鈉、磷酸均為化學純;L-門冬氨酸(上海協和氨基酸有限公司，批號分別為110103，110707，111210)。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4．6 mm，5 μm);流動相:A為12．5 mmol/L磷酸鈉溶液(用磷酸調pH至6．8)，B為乙腈-水(80∶20)，按表1進行梯度洗脫;流速:1．0 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:254 nm。

表1 流動相梯度洗脫程序

2．2 溶液制備

精密稱取門冬氨酸對照品25 mg，置25 mL容量瓶中，用50% 乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，精密量取 0．5，1．0，2．0，4．0，6．0，8．0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成50，100，200，400，600，800 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。精密稱取門冬氨酸樣品12．5 mg，置100 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2．3 衍生和測定方法

15%異硫氰酸苯酯乙腈溶液:量取異硫氰酸苯酯15 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。1 mol/L三乙胺乙腈溶液:量取三乙胺14 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。取標準品和樣品各2 mL，加15%異硫氰酸苯酯乙腈溶液1 mL，加1 mol/L三乙胺乙睛溶液1 mL，混勻，室溫放置1 h，加入4 mL正己烷，振搖，放置10 min，取下層清液，過濾，取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖見圖1，按外標法計算門冬氨酸含量。

圖1 高效液相色譜圖

2．4 方法學考察

標準曲線繪制:分別精密量取2．2項下對照品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀按2．3項下條件進行測定，測量峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程 Y=15．712 X ＋11．999，r=0．999 8。結果表明，門冬氨酸質量濃度在50～800 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液20 μL，重復進樣6次，按上述色譜條件測定峰面積。結果的 RSD=0．93%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 時進樣 20 μL。結果門冬氨酸峰面積的 RSD=0．62%(n=7)，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品，按上述方法制備6份供試品溶液，依法測定，結果平均含量為99．3%，RSD=1．0%(n=6)。表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的門冬氨酸(批號為110103，含量為99．3%)9份，各約25 mg，分別精密加入門冬氨酸對照品適量，按2．3項下條件測定進樣，測定含量，計算回收率。結果見表 2。

表2 門冬氨酸加樣回收率試驗結果(n=9)

2．5 樣品含量測定

取3批不同批號的門冬氨酸原料，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶試液20 μL，按上述色譜條件測定并計算含量，并采用藥典方法即高氯酸電位滴定法測定其含量。結果見表3。

表3 門冬氨酸含量測定

3 討論

門冬氨酸現有的含量測定方法為高氯酸電位滴定法，操作步驟多、程序繁雜、結果精密度不高。苯異硫氰酸苯酯衍生產物單一、穩定，可形成一個穩定的苯乙內酰硫脲(PTH)衍生物，即PTH-門冬氨酸，凍干的衍生物在20℃可貯存1個月，色譜響應值無明顯變化;但由于樣品的制備較煩瑣，需預先去除剩余試劑，且存在于樣品中的痕量異硫氰酸苯酯試劑也會縮短分析柱的壽命。

本試驗先后考察了不同的預處理方法與流動相，選用流動相為A 12．5 mmol/L磷酸鈉溶液(用磷酸調pH至6．8)、B乙腈-水(80∶20)進行梯度洗脫，經紫外掃描驗證在254 nm波長處有最大吸收，且色譜峰分離效果良好。方法學考察結果表明，采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化測定門冬氨酸的含量，穩定性好、精密度高、結果可靠、專屬性強，可更好地控制產品質量。

[1]高 春，戴 紅，姚 瑛，等．門冬氨酸鉀鎂葡萄糖注射液中L-門冬氨酸的HPLC測定[J]．中國醫藥工業雜志，2003，34(5):244-245．

[2]楊 揚，秦 強，郭偉忠．苯基異硫氰酸酯衍生氨基酸的高效液相色譜分析[J]．色譜，1994，12(4):296-297．

[3]黃哲 ，隋玉棠，李海生，等．異硫氰酸苯酯柱前衍生法測定安尿通中3種氨基酸含量[J]．現代儀器，2005(2):14-15．

[4]廖寧梅，馬 婕．高效液相色譜法測定門冬氨酸鳥氨酸注射液的含量[J]．中國生化藥物雜志，2007，28(1):52-53．