石薺 提取物對(duì)流感病毒感染小鼠氧自由基損傷的保護(hù)作用＊

臧家娜，鄧麗麗，余陳歡，方 杰，應(yīng)華忠，吳曉寧

(1．浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053;2．浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310000;3．浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，浙江 杭州 310053)

流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)是由流感病毒感染引起的常見的呼吸道急性傳染病。臨床常用的西藥僅通過抑制病毒表面受體而發(fā)揮療效，極易產(chǎn)生耐藥性和不良反應(yīng)[1]。中藥為中華民族瑰寶，在防治流感病毒方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。石薺 (M．scabra)為江浙地區(qū)常用中草藥，省地方標(biāo)準(zhǔn)收錄藥材，在我國分布廣闊，具有清熱解毒、理氣化痰的功效，主治流行時(shí)疫、痰濕內(nèi)蘊(yùn)、瘡毒和慢性支氣管炎等癥。項(xiàng)目組前期研究表明，石薺 提取物(MSE)可顯著改善流感病毒小鼠病理狀態(tài)，延長其存活時(shí)間，提高機(jī)體免疫水平[1-2]。此外其還具有抗炎[3]、抗氧化[4]等多種藥理作用，但其抗流感病毒的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本試驗(yàn)以氧自由基損傷為切入點(diǎn)，探討MSE改善流感病毒性肺炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與動(dòng)物

DYQ-838型高速微型粉碎機(jī)(浙江瑞安永歷制藥機(jī)械有限公司);TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);DC300型萊卡圖像處理顯微鏡(德國萊卡公司)。石薺 藥材采于2009年8月浙江浦江，經(jīng)本校俞冰副教授鑒定為石薺 (Mosla scabra Thunb．)的干燥全草，陰干、粉碎、過40目篩，備用;利巴韋林泡騰片(浙江艾康禮德制藥有限公司，批號(hào)為091210)。甲型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34，由浙江省疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。病毒效價(jià)為1∶512。清潔級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2010-0014;10日齡SPF雞胚，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。本試驗(yàn)在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院ABSL2生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1．2 方法

石薺 提取物的制備:稱取石薺 干燥粗粉500 g，加藥材20倍量的70%乙醇，于90℃水浴回流提取3次，每次1．9 h，提取液減壓濃縮至含醇量10%左右抽濾，以除去樹脂、葉綠素等雜質(zhì)[5]，繼續(xù)回收溶劑至無乙醇味，乙酸乙酯萃取，減壓干燥、粉碎，得棕黃色浸膏粉末，作為供試樣品(MSE)。臨用前以無菌生理鹽水溶解干浸膏粉末，配制成所需試驗(yàn)藥物濃度。

分組及給藥:取清潔級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組、病毒模型組、利巴韋林給藥組(75 mg/kg)和MSE高劑量給藥組(752 mg/kg)、中劑量給藥組(376 mg/kg)，低劑量給藥組(188 mg/kg)，每組10只。各組于攻毒前預(yù)先灌胃給藥3 d，每次給予0．2 mL/10 g，于第3天給藥2 h后在乙醚輕度麻醉下以10倍半數(shù)致死是(LD50)病毒量滴鼻感染小鼠，每只25 μL。連續(xù)給藥至第8天試驗(yàn)結(jié)束。稱重，處死，迅速取肺組織稱重，計(jì)算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率，觀察肺臟形態(tài)，測(cè)定肺組織病毒載量[6-7]，并檢測(cè)肺組織勻漿液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X ±s)表示，以 P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 化學(xué)成分定性檢查結(jié)果

通過堿性鋁鹽比色法測(cè)定了MSE中總黃酮的含量[1]，結(jié)果MSE中總黃酮以蘆丁計(jì)，其平均含量為83．3%。

2．2 MSE對(duì)流感感染小鼠肺指數(shù)及病毒載量的影響

結(jié)果見表1。可見，病毒模型組肺指數(shù)最大，與正常對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P＜0．01)，MSE高、中、低各劑量給藥組均可明顯降低感染小鼠的肺指數(shù)，提高肺指數(shù)抑制率，減輕小鼠流感病毒所致肺炎的病變程度，并呈劑量依賴性;同時(shí)，MSE高、中、低各劑量給藥組肺組織中流感病毒載量明顯降低，其中MSE高劑量給藥組肺組織中流感病毒載量降低最顯著，與病毒模型組比較，具有顯著性差異(P ＜0．01)。

表1 MSE對(duì)流感感染小鼠肺指數(shù)及病毒載量的影響(n=10，X±s)

2．3 MSE 對(duì)感染小鼠肺組織 MDA，SOD，GSH-Px，NOS 和iNOS含量或活性的影響

結(jié)果見表2。可見，病毒模型組感染小鼠肺組織中MDA含量、NOS及iNOS活性明顯升高，SOD和GSH-Px活性明顯降低，與正常對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P＜0．01);MSE各劑量給藥組肺組織中各指標(biāo)含量及活性均有不同程度的改善，且呈劑量依賴性。

表2 MSE對(duì)感染小鼠肺組織MDA，NOS，INOS，SOD，GSH-PX含量或活性的影響(X ± s，n=10)

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，病毒在肺組織內(nèi)復(fù)制的過程中，炎癥細(xì)胞大量趨化、聚集和激活，并釋放過量的炎癥介質(zhì)及氧自由基等，導(dǎo)致組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，通過抗氧化劑治療，可減少流感病毒感染小鼠的肺損傷和死亡[8-9]。因此，本試驗(yàn)以氧自由基損傷為切入點(diǎn)，通過建立急性感染小鼠模型，探討MSE改善流感病毒性肺炎的機(jī)制。

正常情況下，機(jī)體內(nèi)有一套清除自由基的酶系(超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px)，機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)存在動(dòng)態(tài)平衡，生理?xiàng)l件下體內(nèi)自由基處于低濃度動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體受到損傷，或因某種因素體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除能力降低時(shí)，體內(nèi)活性氧自由基增多，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇。另外，MDA作為脂質(zhì)過氧化的重要降解產(chǎn)物，可用于評(píng)價(jià)機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷的程度[10]。NOS主要有結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)2種亞型，iNOS主要由被激活的膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放產(chǎn)生，一般在炎癥中后期大量生成且持續(xù)較長時(shí)間，是炎癥中后期腦損傷加重的重要因素[11]。

黃酮類化合物具有多酚結(jié)構(gòu)，通過奪氫反應(yīng)生成自由基中間體而阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，從而阻止或抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化物及其代謝產(chǎn)物丙二醛MDA和共軛二烯等毒性物質(zhì)的生成。同時(shí)，黃酮類化合物還可調(diào)節(jié)和提高體內(nèi)抗氧化酶活性[2]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，流感病毒感染后，病毒模型組小鼠肺組織中MDA含量、NOS活性及iNOS活性明顯增加，SOD，GSH-Px和T-AOC活性明顯下降，提示病毒感染肺組織存在明顯的脂質(zhì)過氧化損傷及抗氧自由基損傷的能力下降。經(jīng)MSE給藥干預(yù)后，小鼠肺組織中 SOD，GSH-Px和 T-AOC等活力增加，MDA含量明顯減少，NOS及iNOS活性明顯降低，提示流感感染小鼠肺組織脂質(zhì)過氧化損傷明顯減輕，抗氧自由基損傷能力明顯增強(qiáng)。

綜上所述，MSE能夠有效減輕流感病毒引發(fā)的肺組織脂質(zhì)過氧化損傷，提高機(jī)體的總抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)，這可能是其減輕流感病毒性肺炎病理損傷的作用機(jī)制之一。

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