梅毒螺旋體重組抗原TpN47的純化工藝研究＊

章 剛，黃德新，駱曉棟

(深圳大學生化工程技術研究中心，廣東 深圳 518057)

梅毒是臨床上常見的性傳播疾病，迄今為止尚未分離出具有保護性免疫力的抗體，也無有效的疫苗，因此梅毒螺旋體相關抗原的制備，對于疾病的早期診斷和治療，防止血液傳播等顯得尤為重要[1]。用基因工程方法表達的重組抗原易于生產、純化，可實現對生產條件的標準化控制。TpN47是應用聚合酶鏈式反應法從梅毒螺旋體全基因組中擴增膜蛋白的一個片段，克隆到載體pET-HT-JKM中，在BL21(DE3)plysS菌中誘導表達的蛋白，相對分子質量約為47×103，理論等電點為5．81。該蛋白以包涵體的形式存在于表達菌體中，N端含有六聯組氨酸標記，因此可先將包涵體溶解于含有高濃度變性劑的緩沖液中，再進行固定化金屬親和層析(IMAC)[2]分離純化該蛋白。蛋白質一般都是在相對溫和的天然條件下行使其功能，用于建立雙抗原夾心試劑的抗原蛋白必須首先能溶于適當的緩沖液中。因此，變性條件下層析純化的蛋白質必然涉及到蛋白質的復性問題，以解決其溶解性。實際應用中，可以采用兩種方式進行復性，一種是在變性條件下洗脫結合蛋白，然后進行透析或稀釋復性，另一種是蛋白結合在柱上之后，用相對溫和的溶液環境頂替變性溶液環境，待蛋白復性后再進行洗脫操作[3-4]。

1 材料與儀器

Urea，NaCl，NiSO4，Imidazol 均 為 國 產 分 析 純 試 劑;Protein Molecular Weight Marker購自 Amersham;Tris，β-ME 及 SDSPAGE相關試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。電泳儀(Bio-Rad公司);層析系統(安瑪西亞公司AKTA Explorer)，層析介質為Chelating Sepharose Fastflow;離心機為Hitach高速冷凍離心機 CR22F;超聲破碎儀(SONICS＆MATERIALS INC．)。收集的TpN47表達菌體經超聲破菌并離心分離后，得到本研究所需的包涵體。

2 方法與結果

2．1 緩沖液的配制

平 衡 緩 沖 液 A:8 M 尿 素 ，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，pH=8．5;復性緩沖液 B:2 M 尿素，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，pH=8．5;去雜緩沖液 C:2 M 尿素，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，0．04 M 咪唑，pH=8．5;洗脫緩沖液 D:2 M 尿素，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，0．25 M 咪唑，pH=8．5。

2．2 層析樣品液的制備

以30∶1(V/W)的比例用平衡緩沖液A 150 mL懸起5 g包涵體，并補加10 mM β-ME于混懸液中，調溶液pH至8．5，室溫下磁力攪拌作用240 min后，19 000 r/min離心15 min，所得上清液即為層析樣品液。

2．3 TpN47 的純化

層析柱XK16/20，層析介質為Chelating Sepharose FF，取25 mL按要求進行處理。將已制備的層析樣品液分作2份，其中1份體積為100 mL，另1份為50 mL。層析過程檢測波長為280 nm。填料裝柱后依次用10個柱體積純水、0．5個柱體積的0．1 M NiSO4、3個柱體積純水流過層析柱，接著用5個柱體積平衡緩沖液A平衡柱子待用。分別對2份層析樣品液進行如下層析操作:上樣，以平衡緩沖液沖洗2個柱體積，用2個柱體積復性緩沖液平衡層析柱，使變性蛋白柱上復性，接著用4個柱體積去雜緩沖液除去雜質，最后用3個柱體積洗脫緩沖液洗脫，緊接著用平衡緩沖液A沖洗柱子，再用洗脫緩沖液D沖洗柱子。收集以上各環節樣品進行SDS-PAGE的分析。

2．4 層析圖譜

100 mL層析樣品液的層析圖譜及SDS-PAGE分別見圖1及圖2，50 mL層析樣品液的層析圖譜及SDS-PAGE分別見圖3及圖4。

圖1 IMAC層析圖譜(100 mL上樣量)

圖2 IMAC層析(100 mL上樣量)組分的SDS-PAGE分析

圖3 IMAC層析圖譜(50 mL上樣量)

圖4 IMAC層析(50 mL上樣量)組分SDS-PAGE分析

3 討論

蛋白質復性是應用基因重組技術在菌體中生產蛋白質的瓶頸。蛋白質復性是一個過程，存在中間階段，此階段的各種相互作用決定了蛋白質能否復性。蛋白質復性要求有一定的條件，如pH、溫度、離子強度、蛋白質濃度等。另外，多種添加劑能促進蛋白質復性，其中包括表面活性劑、低濃度變性劑、分子伴侶蛋白和各種氧化還原劑等。由于純化目的是得到較高純度的蛋白，添加劑的使用可能有助于蛋白質復性，但在最終產品中必須去除。為了不引入新的雜質，本研究根據以往經驗采用柱上復性的方法，即蛋白結合在柱上之后，用相對溫和的溶液環境頂替變性溶液環境，待蛋白質復性后再進行洗脫，取得了良好的結果。

常規層析操作的完整流程是平衡、上樣、淋洗、洗脫、再生，然后可進入下一個操作循環。對于IMAC，在除雜操作之后，250 mM的咪唑緩沖液足以洗脫特異性結合蛋白，通常不需要額外的再生操作，只是在經過數個操作循環之后，柱載量明顯下降時才進行徹底的再生操作，即用EDTA絡合緩沖液除去基質結合的金屬離子，徹底清洗基質后，再重新結合上金屬離子。本試驗層析純化出現了異常現象，由圖1可知，在250 mM的咪唑緩沖液洗脫操作結束后，用平衡緩沖液A平衡柱子的過程中出現了一個大的平衡緩沖液洗脫峰(2)，這是常規層析操作中少有的現象。SDSPAGE分析平衡緩沖液A平衡柱子過程中出現的洗脫峰(2)表明其主要成分為目標蛋白。上樣完畢后緩沖液A的淋洗沒有出現洗脫峰，而在洗脫液D洗脫特異性結合蛋白后緊接著再用A液洗柱出現較大的洗脫峰(2)，說明此時被洗脫的結合蛋白是在洗脫液D洗脫時由于某種原因滯留在層析柱中，而且這種滯留蛋白不是與介質發生該層析過程所應有的特異性結合，而是在金屬螯合以外作用力之下吸附在柱上。滯留蛋白產生的原因可能是洗脫液D條件下洗脫蛋白的局部過濃導致部分蛋白以固體形式析出，也有可能是柱上復性過程中產生了不溶性產物，具體成因尚待進一步研究。當緩沖液A流經柱子時，在緩沖液A中高濃度尿素作用下析出蛋白又重新溶解并解吸附，由于緩沖液A中沒有咪唑等頂替劑，重新溶解的蛋白其中一部分又能與層析介質上的金屬離子結合，從而再次結合在柱上。另一部分蛋白由于受蛋白溶解動力學以及與金屬離子的結合反應動力學限制，不能與介質有效結合因而流出柱子形成吸收峰。流出柱子的蛋白量的多少取決于柱中滯留蛋白的多少，而這在一定范圍內與上樣量呈正相關，這一點在減少上樣量后得到了初步驗證。基于以上分析，在出現異常現象，即在洗脫液D洗脫特異性結合蛋白后緊接著再用A液洗柱出現較大的洗脫峰時，改變常規操作，用洗脫液D洗脫液再次洗脫，可得到較為可觀的目標組分，從而在不增加上樣次數的情況下提高了目標產物的收率。

本研究結果在其他蛋白質變性條件下金屬螯合親和層析純化中得到了較好的應用，對于變性條件下其他吸附性色譜純化蛋白的研究也可能具有一定的參考價值。

[1]盧海蓉，王曉紅，陳少娟，等．梅毒螺旋體重組抗原的表達及在梅毒血清學診斷中的應用[J]．中國生物工程雜志，2009，29(6):41-45．

[2]Porath．Amino acid side chain interaction with chelate-ligand crosslinked dextran，agrose and TSK gel．A minireview of recent work[J]．Mol Recogn，1990，3:123-127．

[3]谷振宇，蘇志國．蛋白質的層析折疊復性[J]．化工學報，2000，51(S1):325-329．

[4]王 穎，董曉燕，孫 彥．蛋白質復性技術研究進展[J]．生物工程進展，2002，22(2):61-65．