正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)方刺山柑膠囊水提取工藝

袁濤 楊偉俊 薛文采 程波

復(fù)方刺山柑膠囊是新疆藥物研究所自主研發(fā)的復(fù)方藥物，由刺山柑、川西獐牙菜、波棱瓜子、大黃、苦荬菜、木香、兔耳草、唐古特烏頭、角茴香、甘草、金錢草、訶子、黃芪等多味藥材組成，具有清熱解毒，疏肝利膽、利濕退黃之功能，用于急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎屬肝膽溫?zé)嶙C者。根據(jù)處方各藥味理化性質(zhì)結(jié)合本方功效，課題組前期以蒽醌類等有效成分為指標(biāo)，對處方中刺山柑等藥味進(jìn)行了乙醇提取工藝研究［1］。本文繼以甘草酸銨含量、沒食子酸含量、浸膏得率為綜合評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對處方中甘草、黃芪、金錢草、訶子的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為該制劑的制備工藝提供支持。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

甘草酸銨、沒食子酸對照品(均由中國藥品生物制品檢定所提供，批號依次為110731-200614、110818-200404);訶子等藥材購自安徽亳州中藥材公司，經(jīng)檢驗(yàn)符合相應(yīng)的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。甲醇為美國Fisher 公司產(chǎn)色譜純，醋酸銨、冰醋酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

SPD-10AVP 型高效液相色譜儀(日本島津制造所)，包括LC-10ATVP 二元高壓泵，SPD-10AVP 紫外檢測器，CTO-10ASVP 柱溫箱，SCL-10AVP 系統(tǒng)控制器;LibrorAEG-200 電子天平(日本島津制造所);Millipore simplicity-185 超純水器(美國密理博公司);LS-3120 超聲波發(fā)生器(美國科學(xué)系統(tǒng)公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草酸銨含量測定方法［2］

2.1.1 色譜條件 Diamonsil 柱(250×4.6 mm，5 μm);甲醇-0.2 mol·L－1醋酸銨-冰醋酸(67:33:1)為流動相;柱溫:30 ℃;檢測波長為250 nm;流速1 ml·min－1。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取甘草酸銨對照品適量，加甲醇制成每1 ml 含0.176 mg 的溶液(折合甘草酸為0.1724 mg)，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取水煎液，濾過(0.45 μm 微孔濾膜)，取續(xù)濾液1 ml，置5 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 沒食子酸含量測定方法［3］

2.2.1 色譜條件 Diamonsil 柱(250×4.6 mm，5 μm);甲醇-0.05%磷酸(5:95)為流動相;柱溫:30 ℃;檢測波長為273 nm。流速1 ml·min－1;理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品適量，加甲醇制成每1 ml 含10.4 μg 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取水煎液，濾過(0.45 μm 微孔濾膜)，取續(xù)濾液1 ml，置5 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 浸膏得率測定

精密吸取提取液50 ml，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，按下式計(jì)算。浸膏得率=干浸膏重量/藥材重量×100%。

2.4 評分計(jì)算方法

各因素評分計(jì)算方法:甘草酸銨評分=(甘草酸銨含量/最大甘草酸銨含量)×40%;沒食子酸評分=(沒食子酸含量/最大沒食子酸含量)×40%;浸膏得率評分=(浸膏得率/最大浸膏得率)×20%

綜合評分計(jì)算方法:綜合評分=甘草酸銨評分+沒食子酸評分+浸膏得率評分

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 加水量考察 按處方比例稱取甘草、金錢草(酌余斷碎)、訶子、黃芪，分別加6 倍、8 倍、10 倍、12 倍量水，提取2 次，每次2 小時(shí)，測定甘草酸銨含量、沒食子酸含量和水浸出物量，并計(jì)算綜合評分。溶劑量對甘草酸銨的提取率影響較大，隨著溶劑量的增加，提取率呈上升趨勢，當(dāng)溶劑量在10 倍量以上時(shí)，影響趨于穩(wěn)定;當(dāng)溶劑量在藥材量的8 倍以上時(shí)，對浸膏得率的影響不大;另外，隨著溶劑量的增加，沒食子酸的提取率呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定并略微下降的趨勢，總體趨于平衡。就綜合評分看，在10 倍量溶劑時(shí)綜合評分最高，綜合考慮各因素的相互影響，確定采用8 ～12 倍量溶劑進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝。見表1。

2.5.2 提取時(shí)間考察 按處方比例稱取甘草，金錢草(酌余斷碎)，訶子，黃芪，加8 倍量水，提取2 次，分別提取不同時(shí)間，測定甘草酸銨含量、沒食子酸含量和水浸出物量，并計(jì)算綜合評分。提取時(shí)間對沒食子酸的提取率影響較大，隨著溶劑量的增加，提取率呈上升趨勢，當(dāng)提取時(shí)間在1.5 小時(shí)以上時(shí)，影響趨于穩(wěn)定;提取時(shí)間在1.0 小時(shí)以上時(shí)，對浸膏得率的影響不大;另外，隨著溶劑量的增加，甘草酸銨的提取率呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定并略微下降的趨勢，可能是復(fù)方中發(fā)生成分相互作用，其機(jī)理有待于進(jìn)一步闡明。就綜合評分看，在提取時(shí)間達(dá)1.5 小時(shí)時(shí)綜合評分最高，綜合考慮各因素的相互影響，確定采用1.0 ～2.0 小時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝。見表2。

2.5.3 提取次數(shù)考察 按處方比例稱取甘草，金錢草(酌余斷碎)，訶子，黃芪，總共加20 倍量水，分別提取不同次數(shù)，總共提取2 小時(shí)，測定甘草酸銨含量、沒食子酸含量和水浸出物量，并計(jì)算綜合評分。提取次數(shù)對沒食子酸的提取率影響較大，隨著提取次數(shù)的增加，提取率呈上升趨勢，當(dāng)提取次數(shù)在2 次以上時(shí)，影響趨于穩(wěn)定;提取次數(shù)對浸膏得率和甘草酸銨的影響不顯著。就綜合評分看，綜合平分隨提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)上升趨勢，考慮大生產(chǎn)的可操作性和控制成本，綜合考慮各因素的相互影響，確定采用1 ～3 次進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝。見表3。

表1 加水量對甘草酸銨、沒食子酸含量和浸膏得率的影響

表2 提取時(shí)間對甘草酸銨、沒食子酸含量和浸膏得率的影響

表3 提取次數(shù)對甘草酸銨、沒食子酸含量和浸膏得率的影響

2.6 水提取正交試驗(yàn)［4］

2.6.1 因素水平安排 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，考察提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)、加水量(C)三個(gè)因素對甘草酸銨含量、沒食子酸含量及浸膏得率的影響。按L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見表4。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)的因素水平表

2.6.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

從直觀分析知，各因素對綜合評分的影響大小順序?yàn)?A(提取次數(shù))＞B(提取時(shí)間)＞C(加水量);每個(gè)因素三個(gè)水平之間的趨勢為A3＞A2＞A1，B3＞B1＞B2，C2＞C1＞C3，直觀分析得提取工藝為A3B3C2，即加10 倍量水煎煮3 次，每次2 小時(shí)。方差分析結(jié)果表明:A 因素的影響具有顯著性(P ＜0.05)，B 和C 因素的影響均不顯著(P ＞0.05)，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，從大工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)能降耗等綜合考慮，以A3B1C1組合為佳。由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計(jì)表的9 次試驗(yàn)中，故對其進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表7。

表5 L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表6 L9(34)正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

三次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，所測各項(xiàng)指標(biāo)均高于正交試驗(yàn)的結(jié)果。說明篩選的工藝可行。故最終優(yōu)化的水提工藝為:甘草、金錢草、訶子、黃芪四味，加水8 倍量提取3 次，每次1 小時(shí)。

表7 L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 采用水提取的依據(jù)

本文采用水為溶劑復(fù)方共煎，主要兼顧了處方各藥味所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)及其與功能主治的相關(guān)性。甘草中主要有效成分為甘草酸，而其α體甘草酸二銨具有治療慢性乙型肝炎作用［5］，對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 具有明顯細(xì)胞毒性和抑制增殖作用［6］;訶子中總酚類化合物對抗氧化活性呈良好的線性相關(guān)［7］;黃芪中黃芪甲苷及黃芪多糖可抑制人肝癌細(xì)胞株的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［8］。金錢草水提取液具有清熱解毒、利尿排石、活血散淤之功效，用于肝、膽結(jié)石、膽囊炎、黃疸性肝炎。根據(jù)上述四味藥所含有效成分的理化性質(zhì)及其藥理學(xué)特點(diǎn)，確定采用水提取，結(jié)合其臨床曾以湯劑復(fù)方煎煮的用藥習(xí)慣，本文選擇復(fù)方共煎。

3.2 考察指標(biāo)在綜合評分中的權(quán)重分配

中藥復(fù)方的化學(xué)成非常復(fù)雜，采用單個(gè)指標(biāo)成分或活性成分難易全面反映提取工藝的優(yōu)劣，本文對藥效明確的藥味采用化學(xué)成分，如甘草中的甘草酸銨和訶子中的沒食子酸為考察指標(biāo)。但此兩種成分并不能夠完全代表有效成分，所以同時(shí)結(jié)合復(fù)方藥物的特點(diǎn)，采用浸膏得率為考察指標(biāo)，兼顧了現(xiàn)代研究和傳統(tǒng)復(fù)方的優(yōu)勢，并根據(jù)相對貢獻(xiàn)值分配權(quán)重。通過上述考察指標(biāo)，使工藝考察緊扣處方功能主治，保證了臨床有效性。

［1］ 焦勝春，楊飛，楊偉俊，等．復(fù)方刺山柑膠囊提取工藝的優(yōu)化［J］．中成藥，2011，33(12):2169-2171.

［2］ 黃富宏，王健，茅淵，等.高效液相色譜法測定小青龍顆粒中甘草酸銨含量［J］.中國藥業(yè)，2012，21(21):28-29.

［3］ 張雅，曹蔚，謝艷華，等.HPLC 法測定復(fù)方燒傷膏中沒食子酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27(5):425-426.

［4］ 楊偉俊，薛桂蓬，邢建國，等．秋水仙風(fēng)濕滴丸的成型工藝研究及 體 外 溶 出 度 測 定［J］．中 成 藥，2007，29(8):1240-1242.

［5］ 李光學(xué)，丁原鳳.肝炎靈聯(lián)合甘草酸二銨治療慢性乙型肝炎的臨床效果觀察［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10(36):250-251.

［6］ 張劍鋒，李浩，李超乾，等.甘草酸二銨對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 增殖和p53 表達(dá)的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(27):2852-2853，2856.

［7］ Harpreet Walia，Rajbir Singh，Subodh Kumar，et al.Effect of fractionation on antiradical efficacy of ethyl acetate extract of Terminalia chebula Retz［J］.African Journal of Pharmacy and Pharmacology，2010，4(5):276-285.

［8］ 吳強(qiáng)，楊雁，薛紹禮，等.黃芪總苷對肝星狀細(xì).胞增殖和合成膠原的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(8):892.

［9］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:204-205.