應用單核苷酸多態性芯片研究單親二體型來源及致病機制*

鄧　妮，　郭佩玲，　尹玉竹，　章　鈞，　田　琪，　侯紅瑛

(中山大學附屬第三醫院產科，廣東 廣州 510630)

單親二體型(uniparental disomy，UPD)是指一對同源染色體均來自一個親本,在新生兒中發生率約為0.029%，至今文獻已報道了約1 100例整體型UPD和120例部分型UPD[1]。據Kotzor等[2]統計，文獻報道的母源性16號染色體UPD(maternal UPD of chromosome 16,mUPD 16)約為50余例，其臨床表型多變，從無任何異常臨床表型到智力障礙、發育遲緩、結構畸形等均見報道。mUPD 16由于已知病例均屬于涉及整條染色體的整體型單親二體型，因此16號染色體上因UPD而致病的區段及基因迄今無法定位，其致病機制也難以分析。雖然僅涉及16號染色體部分片段的部分型UPD 16病例可以幫助研究人員確定導致具體臨床癥狀的染色體區段，并進一步確定致病的關鍵基因、明確基因功能和致病機制，但迄今尚無報道。我院自2012年起，應用單核苷酸多態性芯片(single nucleotide polymorphism array, SNP array)技術對124例孕婦羊水中的胎兒細胞及父母親外周血細胞進行全基因組拷貝數分析，共發現2例部分型mUPD 16。本研究對這2例部分型mUPD 16進行回顧性分析，探討SNP array在單親二體型來源和致病機制研究及遺傳咨詢中的應用價值。

材　料　和　方　法

1研究對象

我院自2012年起，對具有唐氏綜合征高風險、需行羊水胎兒細胞G 顯帶染色體核型分析的124例孕婦，在征得孕婦及丈夫的同意后，同時應用SNP array對羊水中的胎兒細胞進行全基因組拷貝數分析，共發現2例部分型mUPD 16。2例孕婦經核實孕周后，在妊娠20周前的超聲檢查中發現胎兒雙頂徑和股骨長均小于正常孕齡的第10位百分數[3]，存在均稱型胎兒生長受限征象,并已排除其它可能導致均稱型生長受限的高危因素的存在，如TORCH綜合征、宮內感染、抗磷脂抗體綜合征、存在狼瘡抗凝物等。妊娠22～26周三維彩超結果未發現明顯的胎兒畸形，羊水細胞G顯帶核型分析顯示核型正常，見表1。

表1　2例病例的臨床資料、核型分析和SNParray結果

G1P0：gravidity time is 1 and parity time is 0; G4P0：gravidity times are 4 and parity time is 0; BPD: biparietal diameter; FL: femur length.

2方法

2.1胎兒及父母親樣本提取與處理羊膜腔穿刺術中，在超聲引導下經腹抽吸羊水20 mL，分別裝在2支消毒試管內，加蓋，其中1管行羊水細胞培養G顯帶染色體核型分析。羊水細胞培養G顯帶核型分析按經典方法進行，羊水細胞分離后加入羊水培養基(Gibco)培養7 d后，分離細胞經洗滌、低滲、固定、滴片、后固定、脫水、老化、染色后在顯微鏡下根據染色體條帶進行判讀、分析[1]。另外1管羊水細胞懸液經離心后獲取羊水細胞，使用QIAmp DNA Mini Kit(Qiagen)提取羊水細胞基因組DNA。另外，用肝素鈉抗凝管和EDTA抗凝管分別抽取孕婦及其配偶肘靜脈血各2 mL，分別用于胎兒父母外周血淋巴細胞培養G顯帶染色體核型分析和提取DNA。

2.2母血污染鑒定分別對羊水DNA標本和母親DNA標本進行短串聯重復序列 (short tandem repeat, STR)擴增(Devyser V3)并比對[4]。按說明書要求進行結果分析，凡可能存在母源性污染的羊水沉渣樣本一律舍棄，重新分離培養以后的羊水細胞并提取DNA用于下一步分析。

2.3SNP array檢測和基因組拷貝數變異分析選用Illumina的HumanCytoSNP-12對羊水細胞基因組DNA和胎兒父母親外周血淋巴細胞DNA進行拷貝數變異(copy number variation, CNV)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)檢測,芯片構成見www.illumina.com。嚴格按照產品操作手冊進行全基因組擴增、標記、雜交、洗滌及熒光掃描,掃描結果采用Karyotyping和GenomeStudio軟件進行分析。選取Illumina公司提供的人類基因組單倍型數據作為實驗對照。根據原始熒光值和對照數據計算Log R Ratio值和B等位基因頻率(B allele frequency,BAF) 判斷等位基因拷貝數和基因型。Log R Ratio值低于1表示存在拷貝數缺失,大于1表示存在拷貝數重復。BAF值為0.5代表雜合型(AB),0和1分別代表純合型(AA和BB)。軟件根據連續位點拷貝數和基因型計算CNV的連續區段,進行t檢驗并給予Confidence值。分別選擇Confidence>50,片段長度>100 kb作為CNV入選標準以及Confidence>50,片段長度>5 Mbp作為LOH入選標準。篩選獲得的片段在UCSC數據庫(www.ucsc.edu)中進行分析，并與目前國際上已有的正常人群數據庫DGV數據庫(http://projects.tcag.ca/variation)比對,通過查詢表型數據庫DECIPHER (https://decipher.sanger.ac.uk/)、PubMed數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)和OMIM數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)分析CNV和LOH的臨床意義。將CNV和LOH進行分類:(1)多態:相似的重復或缺失出現在3個或3個以上的正常人；(2)良性:與異常表型存在或增高的風險無關,遺傳自正常的父母；(3)致病:與已知的異常表型相關,或與不同外顯的異常表型相關或與異常表型增高的風險相關；(4)未知:不確定遺傳性,或不包含已知致病基因,或不確定臨床重要性[5]。

3結果驗證

CNV結果采用多重連接依賴性探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplication,MLPA)或real-time PCR進行驗證，胎兒LOH結果通過父母SNP array檢測并做連鎖分析進行驗證[6]。

結　　果

1孕婦1羊水中胎兒細胞的SNParray結果

用SNP芯片技術對羊水細胞進行遺傳學分析，結果顯示為部分型UPD 16，分別位于16號染色體短臂末端和長臂末端，具體位點是p12.2～13.3，長度約為21.0 Mbp；16q24.1～24.3,長度約為4.1 Mbp,見表1和圖1。

Figure 1. Human genome-wide SNP array result of Case 1. FR: found region; KR: known region; DGV: Database of Genomic Variants.

圖1例1的人類全基因組SNP分型芯片檢測結果

2孕婦2羊水中胎兒細胞的SNParray結果

用SNP芯片技術對羊水細胞進行遺傳學分析，結果顯示為部分型UPD 16,存在于16號染色體長臂末端，具體位置為16q21～24.3，大小約24.1 Mbp，見表1和圖2。

正常對照樣本的人類全基因組SNP分型芯片檢測結果見圖3。

在圖1～3中，左側方框內藍色點為等位基因的BAF，位于0.5位置表示基因型為雜合子(AB)，位于兩側表示基因型為純合子(AA或BB)；左側方框內紅色曲線為Log R值，提示等位基因的拷貝數，0表示拷貝數中性，無缺失重復，往左偏表示存在片段缺失，往右偏表示存在重復。中間柱狀圖分別為該樣本的變異區域(found region)，已知的致病的變異區域(known region)和已知的正常多態性區域(數據來自Database of Genomic Variants,DGV)。最右側G帶核型圖提示變異區段對應的染色體位置。

Figure 2. Human genome-wide SNP array result of Case 2. FR: found region; KR: known region; DGV: Database of Genomic Variants.

圖2例2的人類全基因組SNP分型芯片檢測結果

3父母外周血細胞G顯帶染色體核型分析和SNParray結果

2例胎兒的核型分別為46,XX和46，XY,父母核型分析亦都正常。SNP array檢測并做同家系3人的基因型連鎖分析發現，2例胎兒的16號染色體非單親二體型部分與雙親的基因型相似度均高于99%，提示該部分染色體分別遺傳自父母雙方；而16號染色體單親二體型部分與父親基因型比較可以排除父源性遺傳可能性，而與母親基因型相似度均高于99%，證實該染色體區段存在父源性缺失，為母源性單親二體型。

討　　論

SNP array技術為本研究2例胎兒存在的均稱型生長受限闡釋了常規G顯帶染色體核型分析技術無法發現的細微片段的染色體改變。針對染色體疾病的診斷，學術界近年來已逐漸形成共識,染色體微陣列技術包括SNP array和比較基因組雜交芯片技術,應該逐漸成為發育障礙或先天畸形個體的首選遺傳學診斷方法[6]。本研究中，除這2例mUPD 16外， SNP array檢測還發現了Williams綜合征、1p36微缺失綜合征、angleman綜合征、Smith-Meganes綜合征等多種已知遺傳綜合征和微缺失微重復綜合征。

Figure 3. Human genome-wide SNP array result of normal control. FR: found region; KR: known region; DGV: Database of Genomic Variants.

圖3正常對照樣本的人類全基因組SNP分型芯片檢測結果

不同類型的mUDP 16對胎兒發育的影響不盡相同[2]。單親二體型的形成與染色體不分離有關， 并通過三體補救、配子互補、單體補救等方式避免非整倍體的出現，從而形成不同類型的單親二體型存活下來[5]。SNP array除了是目前診斷單親二體型的最佳方法外[6]，可以幫助研究人員推測染色體不分離發生的不同時期并確定導致具體臨床癥狀的染色體區段，為進一步進行相關區域的基因序列分析、確定致病的關鍵基因及明確基因功能打下基礎。 (1)單親異二體型是指一對同源染色體分別來自父親或母親的2條同源染色體,其染色體不分離發生在減數分裂Ⅰ期。(2)整體型單親二體型的染色體不分離發生在減數分裂Ⅱ期，為姐妹染色單體的不分離。(3)部分型單親二體型又可分為包含著絲粒在內和不包含著絲粒在內2種類型。單親二體型區域包含著絲粒在內的部分型的形成機制與整體型相類似，只是在姐妹染色單體不分離形成的二體配子與單體配子結合成三體型時發生了部分染色體的交換。本研究發現的2例16單親二體型均為單親二體型區域未包含著絲粒在內的部分型。 目前，這一類型單親二體型形成的具體機制并未被完全闡明，推測可能發生在有絲分裂期。在有絲分裂過程中，同源染色體中一條染色體發生了不包含著絲粒在內的部分缺失，其雜合性缺失由另一染色體的相對應部分進行復制來彌補[6]。這2例病例單親二體型的位置分別位于16號染色體長、短臂末端(例1)和長臂末端(例2)，兩者均在妊娠20周前出現了胎兒生長受限的癥狀，而例1生長受限的癥狀更為明顯。結合其它報道[2]，提示16號染色體長、短臂末端可能均存在與胎兒發育或胎盤功能相關的基因。鑒于該2例病例均未出現結構畸形等癥狀，提示導致結構畸形的相關基因可能位于長、短臂近著絲粒的位置。在以后的研究中，應進行相關區域的基因序列分析來確定致病的關鍵基因及明確基因功能。

對胎兒雙親來說，顯然更關注的是單親二體型對胎兒可能造成的影響及其再次妊娠的復發幾率。從形成機制來看，單親二體型屬于新發染色體變異，即變異個體的雙親任何一方體細胞中都不存在的染色體畸變，按孟德爾遺傳規律來說，再次妊娠復發的幾率極低。而在產前診斷中，對新發染色體變異胎兒的預后評估往往比較復雜，更多的是依靠經驗統計數據。盡管目前文獻累積的部分型mUPD 16病例尚不多見，但既然已有相當一部分mUPD 16患者出現胎兒生長受限和(或)胎兒畸形的報道,這2例胎兒的雙親應該被告知不能排除胎兒生長受限進一步加重以及胎兒和新生兒以后出現畸形的可能性。另外，本研究通過SNP array對胎兒雙親的外周血細胞進行遺傳連鎖分析后發現，這2例UPD 16均為母源性，若母親16號染色體上相關區域存在著特定的隱性致病基因，單親二體型則意味著該基因會成為純合子，胎兒雙親應被告知隱性疾病致病基因的暴露可能會導致一些罕見常染色體隱性疾病的出現[7]。

在本研究中，SNP array 還發現了相當一部分臨床意義不明確的拷貝數變異。SNP array的分辨率高達0.7 kb[8]，而與SNP array技術的高分辨率相隨而生的正是臨床意義不明確的拷貝數變異的高檢測率[9]。隨著SNP array診斷流程逐步規范化及人們對基因組結構和功能相關性理解的逐步改善，人類全基因組SNP array技術在產前診斷中的應用會越來越廣泛。

[參考文獻]

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