浙江漢族長壽人群血脂水平及ApoB基因Xba I-RFLR和3’-VNTR多態性的相關性研究*

盛愛萍，　周　標，　施　達，　沈　毅

(1金華職業技術學院, 浙江 金華 321017;2浙江省疾病預防控制中心, 浙江 杭州 310051;3金華市疾病預防控制中心，浙江 金華 321002; 4浙江大學，浙江 杭州 310058)

根據2007年8月公布的《中國成人血脂異常防治指南》[1]指出,血清總膽固醇(total cholesterol,TC)或低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)升高是冠心病和缺血性腦卒中的獨立危險因素之一。而載脂蛋白B (apolipoprotein B,ApoB)參與體內的脂質代謝，是LDL-C的主要蛋白質成分。本文研究浙江漢族長壽人群的血脂水平及ApoB基因XbaI-限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和3’-可變數目串聯重復序列(variable-number tandam repeat,VNTR)多態性對血脂四項和載脂蛋白水平是否有影響，希望能進一步了解長壽發生的機制。

材　料　和　方　法

1研究對象

研究對象均為漢族，采用以人群為基礎的多組病例-對照研究設計，病例共有2組，一組為長壽老人組(≥90歲)96人；另一組為長壽老人組的子女104人。共設立2組對照，一組選同長壽老人組子女的年齡、職業、性別、經濟收入和居住地相匹配的人群104人為對照，另一組選同長壽老人組子女的年齡、性別相匹配的非長壽老人組(壽命小于70歲)的子女95人為對照。完成長壽老人組體格檢查和血樣采集共80份，有效率為83.3%(80/96)。在長壽老人組家庭中，選擇長壽老人組的子女104人，完成體格檢查和血樣采集共90份，有效率為86.5%(90/104)。完成正常對照組體格檢查和血樣采集共89份，有效率為85.6%(89/104)。完成非長壽老人組的子女體格檢查和血樣采集共87份，有效率為90.6%(87/95)。最終完成共計346份。

2方法

2.1一般指標、ApoB與血脂四項測定由當地衛生院結合農村健康體檢對研究對象進行身高、體重、血壓、血糖等項目檢查和血樣采集，研究對象于清晨空腹狀態下靜脈采集2.5 mL全血，靜置后分離血清，送當地醫院檢驗科檢測ApoB和血脂四項:TC、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和LDL-C。ApoB檢測采用ApoB檢測試劑盒，注冊證書編號為浙食藥監械(準)字2006第2400247號，產品標準YZB/浙1332-2006。血脂四項指標檢測采用日立BM717全自動生化分析儀，德國Centronic試劑。儀器用廠家配套的校準品校準，各項目均采用有效的質量控制措施，嚴格按照說明書操作。

2.2基因多態性分析基因組DNA抽提采用改良鹽析法。應用 PCR方法擴增ApoB基因第26外顯子，上、下游引物分別為：5′-ACC GGC CCT GGC GCC CGC CAG CA-3’和5′-AGC AGC AAG AGT CCA CCA ATC-3’。采用PxE Thermal Cycler 5.0擴增儀進行擴增， PCR擴增后，用10 U限制性內切酶XbaI于37 ℃水浴消化4 h。在瓊脂糖凝膠中電泳后觀察紫外燈下帶型。出現1條長度為359 bp的條帶，為X-X-純合子；出現359 bp、229 bp和130 bp 3條帶，為X+X-雜合子；出現229 bp和130 bp 2條帶，為X+X+純合子,見圖1。

Figure 1. The result ofApoBgeneXbaI RFLP genotyping.M:marker；0,3,4: X-X-；2,5:X+X+；1,6:X+X-.

圖1ApoB基因XbaIRFLP分型結果

應用 PCR方法擴增ApoB基因3’端 VNTR重復序列，上、下游引物分別為：5′-AAC GGA GAA ATT ATG GAG GG-3’和 5′-GCA CAT GAA GAC ACC AGA GG-3’。將PCR產物冷卻，置4 ℃保存。分型采用 PCR擴增的 DNA片段電泳法。以已知長度的DNA片段為標準，對等位基因進行分級。以核心序列的重復次數為標準，對等位基因進行命名。串聯重復序列的拷貝數=(片段長度-151 bp)/15 bp。不同的等位基因可組合成不同的基因型，見圖2。

Figure 2. The result ofApoBgene 3’-VNTR genotyping. M:marker;fragment length of 22 is 480 bp，copy numberof repeat sequences=(480-151) bp/15 bp；fragment length of 24 is 510 bp，copy number of repeat sequences =(510-151) bp/15 bp；and so on.

圖2ApoB基因3’-VNTR分型結果

3統計學處理

采用EpiData 3.1軟件建立數據庫。正態分布計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示,組間均數比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；偏態分布計量資料用中位數(四分位數間距)表示,組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；計數資料用2檢驗。進一步采用多元線性回歸分析長壽與對照組在各體格檢查指標上的差異。采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1人口學特征

長壽老人、長壽子女、正常對照和非長壽子女4組在性別上差異無統計學意義;長壽子女組、正常對照組與非長壽子女組在年齡、文化程度和獨居生活上差異均無統計學意義,見表1。

表1　長壽及對照組的人口學特征

Age,education and living alone in the children of longevous elders，normal control group and the children of non-longevous elders were not significant different (P>0.05)

2體格檢查結果比較

除了肝功能以外，4組人群在下述各體檢指標上均存在顯著差異。各組的兩兩比較采用SNK法，身高為長壽老人<長壽子女=正常對照=非長壽子女；體重和體重指數(body mass index,BMI)均為長壽老人<長壽子女=正常對照<非長壽子女；收縮壓為長壽老人=非長壽子女=正常對照<長壽子女；舒張壓為長壽老人=長壽子女<正常對照=非長壽子女；血糖為長壽老人=正常對照=非長壽子女>長壽子女；TC為長壽老人=非長壽子女>正常對照>長壽子女；TG為長壽子女<長壽老人=正常對照<非長壽子女；HDL-C為長壽老人=長壽子女>正常對照>非長壽子女；LDL-C為長壽老人=長壽子女<正常對照=非長壽子女；ApoB為長壽老人=長壽子女<正常對照<非長壽子女,見表2。

表2　長壽及對照組體檢特征

The data of ALT and TG were expressed as median (interquartile range) and compared using Kruskal-Wallis test.

3長壽及對照組體檢特征的多元線性回歸

考慮到4組在社會人口學特征上還存在著分布上的差異，在多元線性回歸中，以正常對照組為參照，控制了年齡、性別、民族、獨居及教育等社會人口學因素的影響，進一步了解長壽與對照在體檢特征上的差異。

以正常對照組為參照，非長壽子女組在BMI上的回歸系數β=0.978(P<0.05)，也就是說，BMI與非長壽呈正相關，表明BMI增大不利于長壽；長壽老人及長壽子女組收縮壓、舒張壓和血糖的回歸系數均為負值，其中長壽子女組有統計學意義，也就是說，收縮壓、舒張壓和血糖與長壽呈負相關，表明高血壓及高血糖不利于長壽；長壽子女組TC、TG、LDL-C及ApoB的回歸系數均為負值，且除TC外，其余均有統計學意義，也就是說，上述指標與長壽呈負相關，表明這些指標的升高不利于長壽。非長壽子女TC、TG、LDL-C及ApoB的回歸系數均為正值，且除LDL-C外，其余均有統計學意義，表明上述指標與非長壽呈正相關，同樣說明這些指標的升高不利于長壽；長壽子女組HDL-C的回歸系數均為正值，且有統計學意義(P<0.01)，也就是說，HDL-C與長壽呈正相關，表明HDL-C升高有利于長壽,見表3。

4長壽及對照組ApoB基因多態性特征

ApoB的XbaI-RFLP有3種基因型：X-X-、X+X-及X+X+。4組中以X-X-基因型為主，分別占86.2%、86.7%、87.6%和86.2%，其次是X+X-基因型，分別占12.5%、13.3%、12.4%和13.8%。X+X+基因型只在長壽老人中發現1例。4組在3種基因型的分布上差異無統計學意義(P>0.05)。等位基因4組均以X-等位基因為主，分別占92.5%、93.3%、93.8%和93.1%。4組在等位基因的分布上也沒有顯著差異(P>0.05)。

ApoB基因3’-VNTR多態性基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，等位基因共有15種, 最大的等位基因是HVE 52，最小的等位基因是HVE 22。以HVE 38為界，可將等位基因分為小等位基因(HVE<38)和大等位基因(HVE≥38)。4組中小等位基因分別占96.2%、96.7%、85.4%和80.0%，長壽人群及其子女小等位基因所占比例較高,差別有統計學意義(P<0.01),見表4。

5不同基因型間血脂及ApoB水平比較

擁有X+X-基因型的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于擁有X-X-基因型的人，且除TG外，均有統計學意義(P<0.01)。與此相反，擁有X+X-基因型的人，其HDL-C低于擁有X-X-基因型的人，差別有統計學意義(P<0.01)。擁有X+X-基因型的人ApoB含量顯著高于擁有X-X-基因型的人(P<0.01)。

表3長壽及對照組體檢特征的多元線性回歸

Table 3. Multiple liner regression of physical characteristics in longevity and control groups

Variableβ(SE)StandardizedβPBMI　Longevouselders-1．200(1．140)-0．180>0．05　Childrenoflongevouselders0．330(0．407)0．051>0．05　Childrenofnon?longevouselders0．978(0．474)0．151<0．05SBP　Longevvouselders-1．808(3．112)-0．039>0．05　Childrenoflongevouselders-6．980(3．255)-0．139<0．05　Childrenofnon?longevouselders0．495(3．783)0．010>0．05DBP　Longevouselders-7．397(4．568)-0．275>0．05　Childrenoflongevouselders-6．163(1．632)-0．239<0．01　Childrenofnon?longevouselders2．637(1．896)0．106>0．05ALT　Longevouselders0．091(0．124)0．129>0．05　Childrenoflongevouselders0．011(0．044)0．017>0．05　Childrenofnon?longevouselders0．077(0．052)0．112>0．05GLU　Longevouselders-0．101(0．571)-0．030>0．05　Childrenoflongevouselders-0．607(0．204)-0．189<0．01　Childrenofnon?longevouselders0．389(0．237)0．120>0．05TC　Longevouselders0．077(0．550)0．128>0．05　Childrenoflongevouselders-0．335(0．196)-0．106>0．05　Childrenofnon?longevouselders0．574(0．228)0．180<0．05TG　Longevouselders0．269(0．692)0．065>0．05　Childrenoflongevouselders-0．516(0．247)-0．131<0．05　Childrenofnon?longevouselders0．626(0．287)0．157<0．05HDL?C　Longevouselders0．022(0．056)0．050>0．05　Childrenoflongevouselders0．119(0．020)0．277<0．01　Childrenofnon?longevouselders-0．043(0．023)-0．098>0．05LDL?C　Longevouselders0．148(0．106)0．186>0．05　Childrenoflongevouselders-0．136(0．038)-0．179<0．01　Childrenofnon?longevouselders0．071(0．044)0．092>0．05ApoB　Longevouselders0．006(0．075)0．009>0．05　Childrenoflongevouselders-0．132(0．027)-0．227<0．01　Childrenofnon?longevouselders0．101(0．031)0．172<0．01

表4　長壽及對照組ApoB基因多態性特征

ApoB基因3’-VNTR大等位基因與小等位基因在血脂及ApoB的水平上也存在著差異。擁有大等位基因的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于擁有小等位基因的人，且差異均有統計學意義(P<0.01)。而HDL-C在擁有大等位基因的人體內含量較低，差別有統計學意義(P<0.01)。從ApoB的含量上看，擁有大等位基因的人含量顯著高于擁有小等位基因的人(P<0.01),見表5。

表5　不同基因型間血脂及ApoB水平比較

**P<0.01vsX-X-;##P<0.01vsVNTR<38.

討　　論

血脂是血漿中的中性脂肪和類脂的總稱, 廣泛存在于人體中，它們是生命細胞的基礎代謝必需物質。本文研究發現，長壽老人HDL-C含量高于其它3組，而LDL-C含量低于正常對照及非長壽子女組，TC含量也比正常對照及非長壽組要低，這與許多研究結果[2-3]一致，表明HDL-C升高有利于長壽, TC、TG和LDL-C的升高不利于長壽，進一步證實了血脂與長壽有著密切的關系，這可能是因為除HDL-C以外的血脂水平升高會導致冠心病與腦卒中風險增大，進而成為長壽的危險因素。

多數研究[4]證實，ApoB基因XbaI位點是載脂蛋白和血脂表型的相關位點，其多態性與血清脂質水平及ApoB水平密切相關，但不同基因型對不同血脂代謝的影響存在爭議。Boekholdt等[5]發現X+等位基因與較高水平的LDL-C及ApoB有關，而與冠心病的發病風險呈負相關。Puri等[6]的發現則與之有所不同，冠心病組中X-X-基因型頻率顯著高于正常對照組(P<0.05)，且冠心病組中X-X-基因型與增高的血清ApoB及LDL-C相關，而與其它血脂異常無明顯相關，提示X-等位基因與冠心病發病有一定相關性。在Benn等[7]的研究中，X+基因型與增高的總膽固醇、LDL-C和ApoB有顯著相關性(P<0.01)。姜文錫等[8]報道ApoB基因型X+X+與自然長壽呈顯著正相關。本文的研究結果顯示ApoB基因XbaI-RFLP與長壽之間并沒有統計學意義上的關聯，擁有X+X-基因型的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于擁有X-X-基因型的人，擁有X+X-基因型的人，其HDL-C低于擁有X-X-基因型的人，表明擁有X-X-基因型的人血脂水平較健康。

ApoB基因3’-VNTR對血脂、脂蛋白和載脂蛋白水平是否有影響，目前國內外觀點尚不一致。有學者認為冠心病人群中ApoB基因3’-VNTR與任何血脂變量都沒有關系[6]。姜文錫等[9]在維吾爾族人群的研究發現，長壽組中HVE 36和HVE 42頻率顯著高于對照組(P<0.05)，并且HVE 44、HVE 46、HVE 48和HVE 58僅見于長壽組，而HVE 26、HVE 30和HVE 34顯著低于對照組(P<0.05)。Garasto等[10]和Jemaa等[11]認為帶有3’-VNTR大等位基因較帶有小等位基因的個體更易患血脂代謝異常性疾病。國內孟康等[12]對老年高脂血癥患者的研究表明，患者中3’-VNTR大等位基因頻數明顯多于對照組，且TC、LDL-C和HDL-C水平與ApoB基因型增大相關，表明ApoB基因3’-VNTR多態性可能是影響血脂水平的遺傳因素之一。我們認為，ApoB基因3’-VNTR與血脂水平有密切關系，擁有小等位基因的人的TC、TG、LDL-C及ApoB各指標都較低，同時顯示長壽人群及其子女小等位基因所占比例較高(P<0.01)，其可能的機理是：ApoB基因 3’-VNTR十分接近PolyA信號，有可能通過影響PolyA腺苷化，進而干擾mRNA的穩定性，從而影響其表達。也可能是3’-VNTR大等位基因與ApoB基因某一功能性核苷酸序列改變有連鎖不平衡，直接影響脂質代謝從而增加心腦血管疾病的易感性。

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