小鼠巨噬細胞內表達結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白對細胞增殖和凋亡的影響*

任　琳，　李　軼，　王山梅，　師　娟，　郭　思

(河南省人民醫院感染控制科，細菌室，河南 鄭州 450000)

結核分枝桿菌是一種典型的胞內致病菌，可以通過多種不同的機制逃逸機體免疫細胞的殺傷及清除，從而在宿主細胞內進行復制和繁殖，并長期存活于機體內。有證據顯示宿主可以通過誘導受感染巨噬細胞的凋亡來抑制胞內結核分枝桿菌的生長[1-2]。進一步的研究表明分枝桿菌毒力株抑制受感染巨噬細胞凋亡的能力要強于分枝桿菌減毒株[3-4]。 比較基因組學分析揭示了結核分枝桿菌中的差異區段1(region of difference 1, RD1)在所有的卡介苗菌株(bacillus Calmette-Guerin,BCG)中是缺失的。相反，RD1存在于結核分枝桿菌和牛分枝桿菌毒力株中[5]。其中，培養濾液蛋白10(culture filtrate protein 10, CFP10)和早期分泌性抗原靶6(early secretory antigenic target 6, ESAT6)是由RD1區的Rv3874和Rv3875兩個基因分別編碼的分泌性蛋白，研究發現CFP10和ESAT6對結核分枝桿菌的毒力起著重要的作用。有實驗證實把CFP10和ESAT6重組到BCG中能使BCG的毒力和免疫性增強[6-8],但其對宿主巨噬細胞凋亡的影響以及相應的毒力機制并未完全闡述清楚。本研究從結核分枝桿菌H37RV株中克隆CFP10-ESAT6基因，將其重組于真核表達質粒pEGFP-N1中，并將重組質粒轉染到RAW264.7巨噬細胞中，檢測細胞內表達CFP10-ESAT6對巨噬細胞毒性以及凋亡的影響，探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結核分枝桿菌毒力中所起到的作用及其可能機制。

材　料　和　方　法

1材料

1.1基因組、質粒和細胞結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA由河南省人民醫院中心實驗室保存。真核表達質粒pEGFP-N1購自Clontech。RAW264.7小鼠巨噬細胞株，由鄭州大學病理生理學實驗室提供。

1.2主要試劑質粒提取試劑盒和PCR清潔回收試劑盒(Omega)；PCR試劑盒、DNA連接試劑盒和DNA marker (TaKaRa)；限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ (Fermentas)；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒(BestBio)；轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)；十字孢堿、氨芐青霉素和新霉素(Merck)；鼠抗GFP單克隆抗體(Sigma)；羊抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz)；FITC標記抗小鼠Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)(Biolegend)；結核分枝桿菌19 kD脂蛋白由河南省人民醫院中心實驗室提供；其余常規試劑均為國產或進口分析純產品。

2方法

2.1CFP10/ESAT6融合基因PCR擴增及真核表達質粒的構建根據GenBank中結核分枝桿菌H37Rv株CFP10和ESAT6基因序列設計引物。上游和下游引物分別引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。CFP10基因上游引物P1： 5’-GC AAGCTT ATG GCA GAG ATG AAG ACC-3’；CFP10基因下游引物P2：5’-GCT GCC GCC ACC GCC GGA TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GAA GCC CAT TTG CGA GGA C-3’;ESAT6基因上游引物P3：5’-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA TCC GGC GGT GGC GGC AGC ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT - 3’;ESAT6基因下游引物P4：5’TA GAATTC CTA TGC GAA CAT CCC AGT G- 3’(劃線部分分別是HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點，引物由Invitrogen合成)。以結核分枝桿菌H37Rv株全基因組DNA為模板，分別以引物P1/P2和P3/P4進行第1輪PCR擴增，獲得下游帶有中間接頭序列的CFP10基因和上游帶有中間接頭序列的ESAT6基因。PCR擴增體系為：H2O 32.5 μL，5×PrimeSTAR? Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，引物P1/P2或P3/P4(20 μmol/L)各1μL，結核分枝桿菌基因組DNA 1 μL，PrimeSTAR?HS 0.5 μL。反應參數為：94 ℃預變性4 min，98 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環后72 ℃延伸2 min。反應結束后取5 μL擴增產物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。然后再以CFP10和ESAT6基因PCR產物為模板，以引物P1/P4進行第2輪PCR擴增，獲得由中間接頭序列連接的CFP10-ESAT6融合基因。PCR擴增體系為：H2O 31.5 μL，5×PrimeSTAR? Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，引物P1/P4(20 μmol/L)各1 μL，CFP10和ESAT6基因PCR擴增產物各1 μL，PrimeSTAR? HS 0.5 μL，總體積為50μL。CFP10-ESAT6融合基因與質粒pEGFP-N1分別用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切，純化。CFP10-ESAT6融合基因與pEGFP-N1質粒以摩爾比10∶1比例混合，用DNA連接試劑進行連接反應，轉化DH5α感受態細胞，鋪板過夜培養，隨即挑取轉化菌落于LB培養基振蕩培養，提取質粒DNA，做雙酶切和PCR鑒定，以上鑒定正確的陽性克隆送大連TaKaRa生物技術有限公司測序。

2.2重組質粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6的轉染及鑒定使用脂質體法將重組質粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6轉染RAW264.7小鼠巨噬細胞，以構建穩定表達CFP10-ESAT6的RAW264.7小鼠巨噬細胞系。將RAW264.7小鼠巨噬細胞傳代至6孔細胞培養板，當細胞生長處于90%的匯合率時進行轉染。用無菌EP管中制備溶液1：取脂質體10 μL加入到240 μL無血清無抗生素DMEM培養基中；溶液2：取4 μg重組質粒，加入到無血清無抗生素的DMEM培養液250 μL。將溶液1與溶液2混合，在室溫下孵育20 min。用無血清無抗生素DMEM培養液洗6孔板2次，加入2 mL無血清無抗生素DMEM培養液，將重組質粒/脂質體混合液加入培養孔內，搖動培養板，輕輕混勻，設重組質粒/脂質體組和空白對照組。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養6 h，更換含有血清的完全培養基。細胞培養24 h后，去掉培養基，用PBS洗板1次，加入按最佳篩選濃度配制的新霉素(G418)篩選培養基。篩選14 d后，可見有抗性的克隆生長，停藥培養，挑選單克隆，Western blotting鑒定CFP10-ESAT6融合蛋白的表達。

2.3轉染細胞中CFP10-ESAT6融合蛋白表達水平的鑒定收集經過G418篩選的RAW264.7小鼠巨噬細胞，常規提取總蛋白，BCA比色法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，依次加入Ⅰ抗(抗GFP抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，Ⅱ抗(HRP標記的羊抗小鼠IgG)室溫孵育2 h，TBST洗膜，暗室加入ECL液孵育5 min，使用凝膠成像系統觀察CFP10-ESAT6融合蛋白的表達情況。

2.4細胞增殖活性檢測設空白對照組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1/CFP10-ESAT6組，每組各5孔，每孔按細胞數5×103接種于96孔板，然后分別于12、24、48和72 h在每孔中各加入20 μL MTT液，培養4 h，棄去上清，再加入200 μL DMSO，充分振蕩10 min。最后分別檢測3組各時點的吸光度(A490)并重復3次。

2.5Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡設空白對照組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1/CFP10-ESAT6組，將各組細胞接種至6孔板中(1×106cells/well)，培養24 h后，離心收集細胞，用冷PBS洗滌細胞2次，然后用400 μL 1×binding buffer 懸浮細胞，濃度大約為1×109cells/L，在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min，最后加入10 μL PI后輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min。1 h內用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。使用十字孢堿和結核分枝桿菌19 kD脂蛋白，終濃度分別為1 μmol/L和10 mg/L作用于3組細胞，細胞繼續培養72 h，然后按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染凋亡法檢測樣本各時點的凋亡情況。

2.6流式細胞術檢測RAW264.7小鼠巨噬細胞表面TLR2的表達 收集上述各組細胞，1 500 r/min離心5 min，然后用200 μL PBS重懸，重復洗3次，加入FITC標記的抗鼠TLR2Ⅰ抗(1∶1 000)在4 ℃孵育30 min，用PBS洗2次，再用PBS重懸細胞密度為106cells∶300 μL, 然后上流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測細胞凋亡率，CellQuest軟件分析。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合基因PCR擴增及重組質粒的構建

以結核分枝桿菌H37Rv株全基因組為模板，通過PCR擴增出約650 bp左右的特異性片段，與預期的大小一致。限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切重組質粒顯示該重組質粒含有約650 bp片段。測序結果與GenBank數據庫中CFP10和ESAT6基因完全匹配，表明重組質粒構建成功，見圖1。

Figure 1. PCR products ofCFP10-ESAT6 gene and analysis of recombinant plasmid pEGFP-N1/CFP10-ESAT6. M: DNA marker； 1: PCR product ofCFP10-ESAT6 gene inMycobacteriumtuberculosis; 2: recombinant pEGFP-N1/CFP10-ESAT6; 3: recombinant pEGFP-N1/CFP10-ESAT6 digested withHindⅢ andEcoR Ⅰ.

圖1PCR擴增結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合基因及重組質粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6的鑒定

2重組質粒轉染RAW264.7小鼠巨噬細胞中CFP10-ESAT6的表達

使用脂質體轉染法將重組質粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6轉染至靶細胞RAW264.7小鼠巨噬細胞中，以構建穩定表達CFP10-ESAT6的小鼠巨噬細胞系。用新霉素篩選轉染的小鼠巨噬細胞，經有限稀釋法單克隆化，連續傳代培養后，分別選取穩定轉染pEGFP-N1和pEGFP-N1/ CFP10-ESAT6的細胞擴大培養，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞呈綠色熒光，傳代10次以上，EGFP仍有80%的陽性率，這些陽性細胞被認為可以穩定表達目的基因。免疫印跡分析表明，含重組質粒的細胞在約43 kD處出現明顯條帶，空質粒細胞蛋白在27 kD處出現條帶，見圖2。

Figure 2. Expression of CFP10-ESAT6-EGFP recombinant protein in stable transfected RAW264.7 mouse macrophages. 1: pEGFP-N1 transfected cells; 2: normal cells; 3: pEGFP-N1/CFP10-ESAT6 transfected cells.

圖2CFP10-ESAT6-EGFP重組蛋白在穩定轉染RAW264.7巨噬細胞中的表達

3細胞內表達CFP10-ESAT6融合蛋白對RAW264.7小鼠巨噬細胞增殖活性的影響

MTT檢測結果表明，與空質粒組和空白對照相比，重組質粒細胞在不同時點吸光度并沒有明顯變化，見圖3。這一結果表明在RAW264.7小鼠巨噬細胞內表達的CFP10-ESAT6融合蛋白對細胞并沒有毒性作用。

Figure 3. Viability of macrophages transfected with CFP10-ESAT6 assessed by MTT. Mean±SD.n=3.

圖3MTT法檢測CFP10-ESAT6轉染巨噬細胞后細胞的增殖活性

4細胞內表達CFP10-ESAT6融合蛋白對RAW264.7小鼠巨噬細胞抗凋亡的影響

為了檢測細胞內表達的CFP10-ESAT6融合蛋白是否能夠抑制巨噬細胞的凋亡，本實驗使用結核分枝桿菌19 kD脂蛋白和十字孢堿分別作用于空白對照細胞、空質粒細胞和重組細胞。當使用結核分枝桿菌19 kD脂蛋白作用于細胞時，結果顯示重組細胞的凋亡率要小于空白對照組和空質粒組，十字孢堿作用于細胞72 h，3組細胞的凋亡率隨著時間的延長而增加，與空白對照細胞和空質粒細胞相比，重組細胞的凋亡率變化并沒有顯著差異，見圖4、5。這一結果表明胞內表達的CFP10-ESAT6融合蛋白并不能抑制十字孢堿所造成的細胞凋亡，但能夠抑制結核分枝桿菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。

Figure 4. Effect ofMycobacteriumtuberculosis19 kD lipoprotein on the apoptosis of macrophages transfected with CFP10-ESAT6. Mean±SD.n=3.*P< 0.05vsnormal.

圖4結核分枝桿菌19kD脂蛋白對轉染CFP10-ESAT6巨噬細胞凋亡的影響

Figure 5. Effect of staurosporine on the apoptosis of macrophages transfected with CFP10-ESAT6.Mean±SD.n=3.

圖5十字孢堿對轉染CFP10-ESAT6巨噬細胞凋亡的影響

5細胞內表達CFP10-ESAT6融合蛋白對巨噬細胞TLR2表達的影響

本實驗進一步檢測CFP10-ESAT6融合蛋白是否能調控結核分枝桿菌19 kD脂蛋白受體TLR2的表達。流式細胞術證實了pEGFP-N1/CFP10-ESAT6細胞組在培養24 h、48 h和72 h后，重組質粒細胞的平均熒光強度明顯低于空質粒組和空白對照組，差異顯著(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. Effect ofMycobacteriumtuberculosis19 kD lipoprotein on TLR2 expression in macrophages transfected with CFP10-ESAT6. The TLR2 expression of macrophages transfected with CFP10-ESAT6 decreased in a time-dependent manner. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal.

圖6結核分枝桿菌19kD脂蛋白對轉染CFP10-ESAT6巨噬細胞TLR2表達的影響

討　　論

結核分枝桿菌是典型的胞內寄生菌，感染巨噬細胞后，結核分枝桿菌能在受感染的宿主細胞中增殖和存活。機體在遭遇到病原微生物感染后誘導受感染細胞死亡或凋亡是宿主先天性免疫反應的一部分[9]，受感染細胞的死亡是機體的一個重要防御機制，這種機制有利于保護其它未受感染的細胞。有研究報道稱宿主巨噬細胞的凋亡能夠減少分枝桿菌的生存能力，是機體抗結核菌胞內感染中先天性免疫反應中的一部分[10-12]。另一方面，有若干研究證實了結核分枝桿菌毒力株能夠抑制宿主巨噬細胞的凋亡?？傊Y核分枝桿菌和宿主巨噬細胞間的相互作用是結核發病機制的關鍵因素，宿主試圖感知細胞內的病原體并誘導感染細胞死亡而病原體則隱藏在宿主細胞內抑制其死亡。

有研究表明分枝桿菌減毒株(BCG, H37Ra)所造成的巨噬細胞凋亡率要明顯高于分枝桿菌毒力株(Mtb-H37Rv,M.bovis)[13]。由于細胞的死亡能夠減弱分枝桿菌的生存能力，所以結核分枝桿菌抑制巨噬細胞凋亡的能力被認為是結核菌的一個致病毒力因素?；蚪M學分析揭示了結核分枝桿菌RD1在BCG中是缺失的，相反，RD1基因片段存在于結核分枝桿菌和牛分枝桿菌毒力株中。RD1基因區段中的CFP10和ESAT6基因作為結核分枝桿菌的重要分泌性抗原，與分枝桿菌的毒力和免疫性密切相關。因此CFP10和ESAT6在結核分枝桿菌和巨噬細胞相互作用的過程中是否具有毒性以及在凋亡中所起到的作用是個值得探討的重要問題。

本研究通過構建pEGFP-N1/CFP10-ESAT6真核表達質粒穩定轉染后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的表達，免疫印跡分析顯示CFP10-ESAT6融合基因得以表達，表明構建的質粒轉染巨噬細胞成功。本實驗通過MTT和流式細胞術的方法檢測巨噬細胞內表達的CFP10-ESAT6融合蛋白對巨噬細胞增殖以及凋亡的影響。本研究發現，以不同時點檢測重組質粒巨噬細胞的增殖情況，其MTT吸光度和空白質粒組、空白對照組相比并沒有明顯變化。實驗結果表明，巨噬細胞內表達的CFP10-ESAT6融合蛋白沒有造成宿主巨噬細胞的損傷和死亡，其本身不具有細胞毒作用。本實驗進一步研究了胞內表達CFP10-ESAT6是否能夠抑制巨噬細胞的凋亡，使用結核分枝桿菌19 kD脂蛋白和非受體依賴的線粒體途徑凋亡誘導劑十字孢堿處理上述各組細胞。我們發現隨著時間的延長十字孢堿處理的各組細胞，其凋亡率都在增加，而且重組質粒細胞組和其它2組細胞相比凋亡率并沒有明顯差異。用結核分枝桿菌19 kD脂蛋白處理上述各組細胞，細胞同樣隨著時間的延長凋亡率在增加，但在24、48和72 h時點，pEGFP-N1/CFP10-ESAT6細胞組的凋亡率要低于其它2組并有明顯差異。上述結果表明胞內表達的CFP10-ESAT6不能改變十字孢堿所造成的凋亡，但可以抑制結核分枝桿菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。目前所知有兩種途徑可以導致細胞的凋亡：通過Fas等死亡受體與相應配體結合所介導的細胞外途徑和促凋亡/抗凋亡蛋白所控制所介導的線粒體途徑 。本實驗用的2種凋亡誘導劑，十字孢堿是蛋白激酶C抑制劑，能夠通過胞內途徑誘導細胞的凋亡，結核分枝桿菌19 kD脂蛋白是巨噬細胞TLR2的配體，同樣能夠誘導巨噬細胞的凋亡[14-15]。上述結果提示了結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白在巨噬細胞內的表達能夠通過細胞外受體途徑保護巨噬細胞免受凋亡，而不是線粒體途徑。本實驗進一步檢測了重組質粒細胞TLR2的表達水平，流式細胞術證實了重組質粒細胞TLR2的表達水平要低于空質粒組和空白對照組，差異顯著并且其TLR2受體表達水平的下降具有時間依賴性。以上結果表明巨噬細胞內表達CFP10-ESAT6融合蛋白能夠抑制結核分枝桿菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡，這一作用是通過下調巨噬細胞表面TLR2受體來實現的。

總之，本研究探討了細胞內表達CFP10-ESAT6融合蛋白對RAW264.7巨噬細胞的毒性作用，該結核分枝桿菌分泌性蛋白本身不會改變巨噬細胞的活性，但該分泌性融合蛋白在細胞內能夠下調TLR2的表達，進而抑制了結核分枝桿菌19 kD脂蛋白所誘導的細胞凋亡，結果提示了作為早期分泌性抗原，該融合蛋白可能通過細胞外受體途徑抑制宿主細胞的凋亡從而有助于胞內結核分枝桿菌的存活和增殖。由于在結核病人體內宿主巨噬細胞功能的調節是非常復雜的，所以我們需要進一步研究結核分枝桿菌分泌性蛋白CFP10-ESAT6在體內對巨噬細胞功能的影響，以便于透徹地掌握結核病的發病機制。

[參考文獻]

[1]Riendeau CJ, Kornfeld H. THP-1 cell apoptosis in response to mycobacterial infection [J]. Infect Immun, 2003, 71(1): 254-259.

[2]Sly LM, Hingley-Wilson SM, Reiner NE, et al. Survival ofMycobacteriumtuberculosisin host macrophages involves resistance to apoptosis dependent upon induction of antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1[J]. J Immunol, 2003, 170(1): 430-437.

[3]Dhiman R, Raje M, Majumdar S. Differential expression of NF-κB in mycobacteria infected THP-1 affects apoptosis [J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1770(4): 649-658.

[4]Zhang J, Jiang R, Takayama H, et al. Survival of virulentMycobacteriumtuberculosisinvolves preventing apoptosis induced by Bcl-2 upregulation and release resulting from necrosis in J774 macrophages [J]. Microbiol Immunol, 2005, 49(9): 845-852.

[5]Behr MA, Wilson MA, Gill WP, et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray [J]. Science, 1999, 284(5419):1520-1523.

[6]Pym AS, Brodin P, Brosch R, et al. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccinesMycobacteriumbovisBCG andMycobacteriummicroti[J]. Mol Microbiol, 2002, 46(3): 709-717.

[7]Lewis KN, Liao R, Guinn KM, et al. Deletion of RD1 fromMycobacteriumtuberculosismimics bacilli Calmette-Guérin attenuation [J]. J Infect Dis, 2003, 187(1): 117-123.

[8]Pym AS, Brodin P, Majlessi L, et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis [J]. Nat Med, 2003, 9(5): 533-539.

[9]Iriti M, Faoro F. Review of innate and specific immunity in plants and animals [J]. Mycopathologia, 2007, 164(2): 57-64.

[10] Molloy A, Laochumroonvorapong P, Kaplan G. Apoptosis, but not necrosis, of infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus Calmette-Guerin [J]. J Exp Med, 1994, 180(4): 1499-1509.

[11] Fratazzi C, Arbeit RD, Carini C, et al. Programmed cell death ofMycobacteriumaviumserovar 4-infected human macrophages prevents the mycobacteria from spreading and induces mycobacterial growth inhibition by freshly added, uninfected macrophages [J]. J Immunol, 1997, 158(9): 4320-4327.

[12] Keane J, Shurtleff B, Kornfeld H. TNF-dependent BALB/c murine macrophage apoptosis followingMycobacteriumtuberculosisinfection inhibits bacillary growth in an IFN-γ independent manner [J]. Tuberculosis (Edinb), 2002, 82(2-3): 55-61.

[13] Keane J, Remold HG, Kornfled H. VirulentMycobacteriumtuberculosisstrains evade apoptosis of infected alveolar macrophage [J]. J Immunol, 2000, 164(4): 2016-2020.

[14] 朱蘭卉，李馮銳，周懿舒，等. 細胞凋亡途徑中HIPPI的潛在調節作用[J]. 中國病理生理雜志，2013, 29(6): 1136-1141.

[15] López M, Sly LM, Luu Y, et al. The 19-KDaMycobacteriumtuberculosisprotein induces macrophage apoptosis through Toll-like receptor-2 [J]. J Immunol, 2003, 170(5): 2409-2416.