肌肽對高糖誘導的H9c2細胞損傷的拮抗作用*

師　巖,　齊曉丹，　張　偉，　張　帆，　寧小美，　李淑艷，　張春晶△

(齊齊哈爾醫學院 1生物化學教研室， 4計算機教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 2內分泌科， 3心胸外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

糖尿病已經成為危害人類健康的重要疾病之一，繼發于糖尿病的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM) 是部分糖尿病患者發生心力衰竭和死亡的重要原因，嚴重影響患者的生活質量，因此對 DCM 患者的早期干預治療有著重要的意義。2004年，美國糖尿病學會(American Diabetes Association, ADA)年會提出了糖尿病及其慢性并發癥都有統一發病機制，即高血糖損傷的共同基礎——氧化應激。氧化應激在 DCM 的發生發展中發揮重要作用，大量氧自由基及活性氧(reactive oxygen species,ROS)直接損傷心肌細胞及血管內皮細胞，引起細胞凋亡，最終表現為心肌細胞功能障礙[1-2]。因此抗氧化治療成為防治糖尿病心肌病的一個有效途徑。大量研究顯示[3]，肌肽作為一種內源性的抗氧化劑,它具有水溶性好、性質穩定、分子量小、易于被機體利用等優點[4]。本實驗以體外培養的大鼠心肌細胞H9c2為對象，建立高糖誘導心肌細胞損傷模型，觀察肌肽拮抗高糖誘導的心肌細胞損傷及其作用機制，為肌肽在臨床用于防治糖尿病心肌病并發癥提供理論依據。

材　料　和　方　法

1材料

H9c2細胞由本實驗室保存(中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心)；肌肽(Sigma)，胎牛血清(HyClone),0.25%胰酶-0.02%EDTA(吉諾生物醫藥技術有限公司),DMEM培養基(Gibco),DCFH-DA(Sigma)?；罨痗aspase-8、caspase-9和caspase-3抗體(Abcam)。流式細胞儀(Becton)。Bio-Rad Gel-Doc凝膠成像系統。

2方法

2.1心肌細胞培養 H9c2細胞常規培養在含10%胎牛血清的DMEM培養液中，于37℃、5% CO2條件下培養。

2.2實驗分組及預處理方式 細胞分組：(1)正常對照組(NC組)：葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；(2)高糖損傷組(HG組)：葡萄糖濃度分別為20、25和30 mmol/L;(3)高糖+肌肽預保護組(Car+HG組)提前6 h加入濃度20 mmol/L肌肽預保護。

2.3MTT法檢測細胞存活率細胞以2×104/well的密度接種于96孔培養板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養液于37 ℃、5% CO2孵箱中培養24 h，棄培養液，換不含血清的新鮮DMEM培養液培養6 h，使細胞同步化。分組給藥同上，每組設6個平行孔，繼續培養24 h、48 h和72 h后，加入50 μL新鮮配制的1 g/L MTT，37 ℃、5%CO2培養4 h后，棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃輕搖10 min溶解紫色結晶。30 min內置酶標儀于490 nm波長下測定吸光度(A)。

2.4DCFH-DA探針檢測ROSH9c2細胞用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，以(1.5～2)×108/L接種于60 mm培養板中。常規培養至75～80%，用不完全DMEM培養液培養48 h。細胞分組同上，每組3個復皿。在經過處理的細胞中加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃、5%CO2孵育20～30 min。細胞沉淀先用PBS洗2次，再用1 mL PBS液重懸細胞后收集至1.5 mL離心管中，然后用流式細胞術測定熒光強度，其激發波長為488 nm，發射波長為510 nm。

2.5Westem blotting檢測蛋白表達收集并裂解細胞，提取蛋白。以等量蛋白上樣進行SDS-PAGE。電泳結束后轉移至 NC 膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉90 min，抗活化caspase-8、caspase-9和caspase-3抗體4 ℃過夜孵育。1∶2 000 HRP-標記的抗體室溫下孵育1 h，ECL Plus 檢測。同時以GAPDH作內參照，采用Bio-Rad Gel-Doc凝膠成像系統對Western blotting結果進行分析。

3統計學處理

運用SPSS 16.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1肌肽對高糖誘導H9c2細胞存活率的影響

與對照組相比，不同濃度葡萄糖刺激24 h后，H9c2細胞的存活率差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。20、25和30 mmol/L葡萄糖處理48 h和72 h后，與24 h相比細胞存活率降低，隨著高糖刺激時間和高糖濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1，提示細胞存活率具有時間、濃度依賴性。30 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，細胞存活率小于40%，25 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，細胞存活率約50%，提示25 mmol/L濃度能兼顧體現高糖導致的氧化應激損傷和適當的細胞死亡率，因此本實驗選擇25 mmol/L為常規高糖刺激組。高糖刺激72 h細胞死亡率過高，選擇高糖刺激48 h，既可造成心肌細胞可逆性氧化應激損傷，又能較好反應抗氧化劑肌肽對心肌的保護作用。25 mmol/L葡萄糖刺激48 h并加入肌肽預保護的細胞中，細胞的存活率較其它高糖組顯著提高，可由高糖損傷組的57.74%±2.43%增加到82.62%±2.61%，差異有統計學意義(P<0.05)。

Figure 1. Effects of different concentrations of high glucose on the survival rate of H9c2 cells detected by MTT assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal control (NC) group.

圖1MTT檢測不同濃度高糖對H9c2細胞存活率的影響

2肌肽清除細胞內自由基的作用

流式細胞術檢測結果見圖2，25 mmol/L高糖刺激H9c2細胞48 h后細胞DCFH-DA的平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)(紅色熒光)與正常對照組細胞(藍色熒光)相比,熒光強度增加42.0%±3.2%，表示ROS水平明顯增高(P<0.05)，而給予20 mmol/L肌肽后，熒光強度(綠色熒光)與高糖組細胞相比降低了35.0%±2.7%(P<0.05)，且與正常細胞相近，說明肌肽可明顯抑制高糖引起的氧化應激反應。

Figure 2. Flow cytometry analysis of DCFH-DA fluorescence intensity. Normal control (NC) group:blue fluorescence; high glucose (HG, 25 mmol/L) group:red fluorescence; carnosine(Car, 20 mmol/L)+HG group:green fluorescence. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖2流式細胞術檢測高糖誘導H9c2細胞48h后細胞內DCFH-DA熒光強度

3Westernblotting分析肌肽對細胞caspase家族蛋白表達影響

Western blotting檢測結果及灰度掃描后的目的條帶與GAPDH比值見圖3。高糖組與正常對照組相比, caspase-3相對含量(6.41±0.65vs2.21±0.53)、caspase-8相對含量(7.32±0.91vs1.15±0.49)和caspase-9相對含量(4.07±0.54vs0.51±0.31)均明顯增多(P<0.05)。肌肽預保護組與高糖組相比，caspase-3相對含量(4.71±0.59vs6.41±0.65)和caspase-9相對含量(2.95±0.41vs4.07±0.54)均顯著降低(P<0.05)，但caspase-8相對含量(7.64±0.89vs7.32±0.91)較高糖組無顯著改變(P>0.05)。以上數據表明，高糖可誘導心肌細胞凋亡，而肌肽可通過下調caspase-9和 caspase-3蛋白表達水平而抑制凋亡。

Figure 3. Protein expression of activated caspase-3, -8 and -9 in H9c2 cells detected by Western blotting. A:normal control(NC) group; B:high glucose(HG,25 mmol/L) group; C: carnosine(Car,20 mmol/L)+HG group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHG group.

圖3Westernblotting法檢測活化caspase-3、-8和-9蛋白的表達

討　　論

1972 年，Rubler 等發現糖尿病患者患有的特異性心肌病變，后被定義為DCM。該疾病包括了微血管病變和心肌細胞代謝紊亂引起的心臟病變。DCM是心肌對糖尿病的急性反應而導致的慢性病理改變，這些急性反應包括基因表達異常、信號轉導改變及細胞凋亡[5]。H9c2細胞源于胚胎期大鼠心臟，保持很多心肌細胞的特征，可用于高糖的體外研究。我們以MTT法檢測H9c2心肌細胞在不同高糖濃度、不同時點的細胞存活率，建立高糖誘導的細胞損傷模型組。研究證明，糖尿病心肌病的重要發病機制之一是高血糖損傷心肌細胞引起ROS生成增多[6]。Fiordalis等[7]在STZ誘導的糖尿病大鼠心臟標本中也發現，DCM增加心肌細胞凋亡的同時，心肌細胞內ROS增加了2倍以上，導致機體氧化應激加強。ROS所致的氧化應激是造成細胞凋亡的重要環節。我們通過DCFH-DA探針檢測ROS，證明了高糖誘發心肌細胞損傷與氧化應激密切相關。近年來Mohammad等[8]證明了抗氧化劑在預防ROS引起的心肌細胞損傷方面可以發揮有益作用。肌肽作為一種內源性抗氧化劑，具有多種抗氧化作用，可以有效清除活性氧和自由基，對于改善與治療2型糖尿病并發癥有很好應用前景[9]，在防治糖尿病腎病、糖尿病視網膜病、糖尿病心血管病及糖尿病神經系統損害等方面已有報道[10]。我們曾發現：一定濃度的肌肽能有效抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，氧化應激在糖尿病血管病變中的損傷作用已得到證實[11]。為了進一步證明肌肽這種抗氧化劑在糖尿病心血管疾病中的作用，本實驗以H9c2細胞為對象，建立高糖損傷模型，研究肌肽抑制高糖誘導的心肌細胞損傷作用及機制。糖尿病心肌病大鼠心肌細胞氧化應激損傷會導致細胞凋亡，其發生主要由2條信號通路介導，即外在途徑和內在途徑[12]。外在途徑是死亡受體介導的信號通路，即胞外凋亡信號與膜上的凋亡受體相結合使caspase-8激活, 活化的caspase-8又激活caspase-3, 誘導凋亡的級聯反應[13]；內在途徑是線粒體介導的信號通路，即各種損傷因素通過促進線粒體釋放細胞色素C等信號分子，然后激活caspase-9和caspase-3而介導細胞凋亡[14]。Caspase蛋白酶家族引發一系列級聯反應，剪切底物使凋亡得以進行，在介導細胞凋亡中起著中心作用。迄今為止，已發現至少13種caspase家族成員參與了細胞凋亡，但在心肌細胞凋亡中以caspasc-3、-8和-9的作用最為重要。為了研究肌肽抑制高糖誘導的細胞損傷的作用，我們利用Western blotting方法重點檢測了caspase家族蛋白中caspase-3、-8和-9的表達量。高糖誘導心肌細胞48 h后，高糖組中caspase-3、-8和-9均高表達。Bojunga[15]等人的研究同樣認為，高血糖增加心肌細胞凋亡的過程中，增加了心肌Fas受體和caspase-8的表達，說明高糖誘導心肌細胞凋亡可以通過外在途徑和內在途徑2條信號通路。而肌肽預保護組的caspase-9和caspase-3表達量降低，caspase-8表達量沒有明顯變化,因此推測肌肽作用于高糖環境下的心肌細胞，可以通過線粒體信號通路介導抗氧化作用，抑制caspase-9和caspase-3表達，保護心肌細胞免受高糖誘導的氧化應激和凋亡損傷，而與外在途徑死亡受體介導的信號通路關系不大。

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