SB203580對急性肺栓塞后肺動脈高壓及MCP-1表達的影響*

陳　淳，　蔡學定，　黃曉穎，　任卓超，　嚴建平△，　王良興△

(1浙江省人民醫院呼吸內科，浙江 杭州 310000;2溫州醫學院附屬第一醫院呼吸內科，浙江 溫州 325000 )

急性肺栓塞(pulmonary thromboembolism , PTE)為臨床常見病、危重病[1]。急性PTE嚴重肺損傷和肺動脈高壓是其引起死亡的直接原因。傳統觀念認為，急性PTE性肺動脈高壓形成與血栓的機械阻塞作用關系密切[1]。然而，近年來研究發現急性PTE血栓的機械阻塞程度與肺動脈壓力的增高并不一致，即使機械性阻塞已基本解除，仍存在肺動脈壓力持續升高[2]。又有研究證實急性PTE時栓塞血管周圍大量炎癥細胞浸潤，其釋放的細胞因子可進一步加重肺動脈內皮的損傷，在PTE性肺動脈高壓的形成中起到不可忽視的作用[3]。單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是活化和聚集單核炎癥細胞至血管內皮細胞的重要介導者。Eagleton等[4]發現在PTE早期，肺動脈壁中MCP-1表達明顯升高同時快速趨化炎癥細胞浸潤至肺動脈壁周圍。可見，在啟動血管的炎癥反應及血管內皮細胞損傷中MCP-1是關鍵的炎癥趨化因子, MCP-1與栓塞性肺動脈高壓形成密切相關。

p38有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是MAPK信號轉導通路組成部分之一，主要調控各種促炎癥因子[5]。多項研究指出激活p38 MAPK通道可以促進MCP-1的大量表達，p38 MAPK是MCP-1產生的關鍵上游分子[6]。p38 MAPK抑制劑被廣泛應用于p38 MAPK對腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、MCP-1等細胞因子調節活性的研究。SB203580是 p38 MAPK特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑的突出代表[7]。目前，關于SB203580干預急性PTE后MCP-1表達以及肺動脈高壓的療效和機制尚不明確。綜上所述，我們推測SB203580可能通過抑制急性PTE后MCP-1的表達，降低急性PTE肺動脈高壓。

本研究通過復制大鼠急性PTE模型，應用MCP-1中和抗體C1142及p38 MAPK特異性抑制劑SB203580對急性PTE后MCP-1表達的影響，評價MCP-1是否參與急性PTE性肺動脈高壓的形成以及SB203580是否通過p38 MAPK信號轉導通路，下調MCP-1的表達，從而降低急性PTE性肺動脈高壓。

材　料　和　方　法

1材料

1.1動物SPF級標準健康雄性Sprague-Dawley大鼠150只，體重300～350 g，溫州醫學院實驗動物中心提供。動物合格證為SCXK(浙)2005-0019。動物采用標準顆粒飼料喂養，自由進食、飲水。

1.2試劑和儀器多克隆兔抗鼠MCP-1抗體(AB.cam)，SB203580(Sigma)，SYBR Green Real-time PCR Master (Toyobo)，C1142(Centocor)，RPMI-1640培養基、胎牛血清、Trizol(Gibco)，PowerLab(AD Instruments)，Bio-Rad PCR System S1000 (Bio-Rad)，聚乙烯導管-1106(中國浙江寧波安來生命科學軟件及器械公司)。

2方法

2.1實驗分組150只 SD 大鼠按完全隨機設計分為正常對照(C組)、溶劑對照組(S組)、急性PTE組(PTE組)、急性PTE+ SB203580(PTE+SB組)和急性PTE+C1142(MCP-1特效中和抗體)組,各組觀察1 h、4 h和8 h 3個時點，每組10只。

2.2急性PTE大鼠模型建立所有大鼠頸部剃除皮毛并對皮膚進行消毒，分離左頸動脈并接入19G頭皮針留取0.5 mL血液使血栓形成。待血栓凝固后將其切成約1 mm×1 mm×3 mm大小的栓子。分離右頸靜脈并插入裝有血栓的聚乙烯導管-1106并與 PowerLab連接。為最大程度地降低血栓輸注過程中大鼠的致死率，設置血栓(180 mg/kg)輸注時間大于5 min。并根據信號采集器顯示的右心室壓力控制在40 mmHg以保證最適宜的血栓輸入量[8]。C組和S組分別輸注等量的0.9%生理鹽水和1% DMSO代替血栓，其余操作相同。分別在各組大鼠血栓輸注后1 h、4 h和8 h，采用改良右心導管法[9]進行肺動脈平均壓力(mean pulmonary artery pressure, MPAP)測量。以上操作均在無菌條件下進行。

2.3C1142及SB203580藥物干預PTE+C1142 組在復制急性肺栓塞模型前1 h予尾靜脈注射C1142 2 mg/kg[10](溶于1%的DMSO)；PTE+SB 組復制急性PTE模型前1 h予尾靜脈注射SB203580 2.5 mg/kg[11](溶于1%的DMSO)；C組于大鼠尾靜脈注入等量無菌生理鹽水；S組大鼠尾靜脈注射等量 1% DMSO溶液；以上操作均在無菌條件下完成。

2.4標本收集各組大鼠均行下腔靜脈取血后處死，切取部分肺組織予4%多聚甲醛固定作免疫組化檢測MCP-1蛋白表達，部分肺組織放入無菌去酶凍存管中經過液氮速凍后再于-70 ℃冰箱保存，并行real-time PCR及Western blotting檢測肺組織MCP-1 mRNA及蛋白表達。

2.5Real-time PCR檢測MCP-1 mRNA表達使用Trizol從100 mg快速冰凍組織中萃取總RNA。RNA濃度定量在波長260 nm處的吸光度，RNA純度在波長260和280 nm (A260/A280)被檢測。取1 μg總RNA與2 μL 5×RT Buffer, 0.5 μL RT Enzyme Mix, 0.5 μL Primer Mix 在Bio-Rad PCR System S1000上進行逆轉錄。將逆轉錄終產物溶于10 μL去RNA酶水中備用。MCP-1上游引物5’-GTCTCTGTCACGCTTCTG-3’，下游引物5’-TGCTGGTGATTCTCTTGTAG-3’。內參照GAPDH上游引物5’-AGAACATCATCCCTGCATCC-3’ 下游引物5’- TGGATACATTGGGGGTAGGA-3’。PCR參數設置如下： 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 62 ℃ 1 min，40個循環。所有PCR結果由ABI 7500 System SDS軟件分析，實驗數據使用2-ΔΔCt方法分析。

2.6免疫組織化學法檢測MCP-1蛋白表達將肺組織經4%多聚甲醛固定后用石蠟包埋切片，將切片放入含兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體室溫下孵育2 h，再與辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗共同孵育1 h，最后用含二氨基聯苯的底物顯色，蘇木精反染。Ⅰ抗用PBS代替作為空白對照組。黃色代表陽性并按黃色深淺代表陽性強弱。

2.7Western blotting 檢測MCP-1蛋白表達肺組織蛋白濃度均使用BCA法檢測。采用15%分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE。分別用兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體(1∶500)的單抗 4 ℃封閉過夜后再與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)孵育2 h。化學發光、顯影、定影。將膠片進行掃描，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析各組蛋白表達。

3統計學處理

采用SPSS 16.0 統計軟件分析，數據進行正態性檢驗，計數資料用均數±標準差(mean±SD)表示；多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnet’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1動物一般情況以及模型建立

大鼠自體PTE模型制備成功率為92.7% (102/110)，死亡率為7.3% (8/110)。大鼠出現呼吸加快加深、口唇發紺、兩肺彌漫性干濕啰音等PTE體征。大體組織見肺膨脹不全,多散在出血灶,肺組織光鏡見肺動脈內有注入的血栓，同時見肺血管壁肌層組織水腫，提示急性PTE模型復制成功，見圖1。

Figure 1. HE staining showed the pulmonary artery walls and thrombi in pulmonary tissues of control group and PTE group (×200).

圖1HE染色示正常對照組及PTE組大鼠肺組織肺動脈壁變化及血栓形成

2SB203580及C1142對急性PTE大鼠MPAP的影響

S組MPAP較C組有降低趨勢，但兩組間的差異無統計學意義(P>0.05)；急性PTE組MPAP顯著高于S組，PTE+SB組MPAP顯著低于急性PTE組，PTE+C1142組MPAP顯著低于急性PTE組，它們之間的差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

Figure 2. The waveform charts of pulmonary artery pressure in control group and acute PTE group. A: control group;B: acute PTE group.

圖2正常對照組和急性肺栓塞大鼠肺動脈壓力波形圖

Figure 3. Mean pulmonary artery pressure (MPAP) in the five groups at the time points of 1, 4, and 8 h. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE.

圖3在1、4和8h時點各組大鼠平均肺動脈壓力值

3Real-timePCR測量各組MCP-1mRNA在肺組織中的表達

各組大鼠肺組織MCP-1 mRNA表達結果顯示，急性PTE組MCP-1 mRNA表達的Ct值較S組顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)，PTE+SB組及PTE+C1142組MCP-1 mRNA Ct值均較急性PTE組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. Effects of SB203580 and C1142 on the expression of MCP-1 mRNA. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖4Real-timePCR檢測各組MCP-1mRNA的表達

4免疫組織化學法檢測各組大鼠MCP-1蛋白在肺組織內的表達

各組大鼠肺組織免疫組織化學法檢測MCP-1蛋白表達結果顯示，C、S組大鼠肺組織內未見明顯MCP-1蛋白表達，急性PTE組MCP-1蛋白表達較S組顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)。PTE+SB組及PTE+C1142組MCP-1蛋白表達較急性PTE組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

5Westernblotting檢測各組大鼠肺組織MCP-1蛋白的表達

各組大鼠肺組織Western blotting檢測MCP-1蛋白表達結果顯示，S組MCP-1蛋白表達與C組比較差異無統計學意義，急性PTE組MCP-1蛋白表達較S組顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)，PTE+SB組及PTE+C1142組MCP-1蛋白表達均較急性PTE組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05),見圖6、7。

討　　論

1急性PTE后MCP-1表達增加參與急性PTE后肺動脈高壓形成

MCP-1屬于趨化因子家族。趨化因子是具有趨化白細胞作用的一類蛋白質或多肽，可分為4類，即趨化因子CXC、趨化因子CC、趨化因子C、趨化因子CNC。MCP-1是趨化因子CC亞族其中一員，位于第17號染色體上，由多種細胞產生，包括單核細胞、內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、脂肪細胞、系膜細胞等[12]。它能夠趨化和活化諸如肥大細胞、樹突狀細胞、T 淋巴細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等炎癥細胞[13]，使各種炎癥細胞向病變部位聚集，通過與各細胞上的CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2, CCR2)結合而發揮生物學作用。近年來，研究證實在啟動血管的炎癥反應中MCP-1可能是關鍵的炎癥趨化因子，是活化和聚集炎癥細胞至血管內皮的重要介導者[14]。又有報道指出，在大鼠PTE模型中觀察到MCP-1在肺組織、肺動脈內皮細胞中均有大量表達，表明MCP-1可能與PTE后炎癥細胞浸潤及肺動脈高壓形成過程密切相關[15]。

Figure 5. Localization of MCP-1 protein in lung tissues of acute PTE rats determined using immunohistochemistry(×100).Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖5免疫組化法測定各組大鼠肺組織中MCP-1蛋白的表達

Figure 6. Effect of C1142 on protein expression of MCP-1 in lung tissues of acute PTE rats measured by Western blotting. β-actin was used to normalize protein loading. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖6Westernblotting檢測C1142干預下各組MCP-1蛋白的表達

Figure 7. Effect of SB203580 on protein expression of MCP-1 in lung tissues of acute PTE rats measured by Western blotting. β-actin was used to normalize protein loading. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖7Westernblotting檢測SB203580干預下各組MCP-1蛋白的表達

本研究發現，急性PTE 1 h和4 h組血栓幾乎阻塞了整個肺動脈管腔，由于血栓機械阻塞作用MPAP顯著增高，急性PTE 8h組血栓對血管的機械阻塞作用較4 h組減少但MPAP值卻未降低，差異無統計學意義。急性PTE由于體內纖溶系統迅速激活[16]血栓開始溶解，為何肺動脈壓力仍持續增高？目前認為可能與栓塞血管周圍大量炎癥細胞浸潤，其釋放的細胞因子加重肺動脈內皮損傷有關[3]，而MCP-1是活化和聚集單核炎癥細胞至血管內皮細胞的重要介導者。Eagleton等[4]發現在PTE后肺動脈壁中MCP-1 表達量明顯升高。本實驗也觀察到急性PTE 8 h組的MCP-1 mRNA及蛋白表達顯著增高。因此，我們推測急性PTE后MCP-1的表達與急性PTE性肺動脈高壓形成相關。為進一步探討MCP-1表達與mPAP關系，我們在1 h、4 h和8 h分別加用MCP-1 特異性中和抗體C1142 進行干預，結果顯示，各相同時點PTE+C1142組mPAP值均較急性PTE組顯著降低，差異有統計學意義。這表明除血栓對肺動脈的機械阻塞作用外，急性PTE后MCP-1的表達增高參與肺動脈高壓的形成。因此，抑制MCP-1表達可能是降低急性PTE性肺動脈壓力的一種有效手段。

2SB203580通過抑制p38MAPK信號轉導通路下調MCP-1表達，從而降低急性PTE性肺動脈高壓

MAPKs是生物細胞內一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。多項研究表明，MAPKs 信號轉導通路將細胞外刺激信號轉導至細胞漿及其核內，在引起生物學反應(如細胞分化、增殖、轉化、凋亡等)過程中具有十分重要的作用[17]。MAPKs通路包括細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、應激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)和p38 MAPK等通路[17]。p38 MAPK通路是1993 年發現的信號轉導通路，一旦被激活，細胞質中的非磷酸化p38 MAPK轉化為磷酸化p38 MAPK，再移位到細胞核內[17]。SB203580是p38 MAPK特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑的突出代表。p38 MAPK具有一個較小的氨基末端結構域和一個較大的羧基末端結構域，氨基末端結構域主要由β折疊組成，羧基末端結構域主要為α螺旋[18]。兩個結構域交界處形成一個裂隙，為ATP結合位點[17]。SB203580并不是通過抑制p38 MAPK上游激酶的活性發揮作用，而是結合于激活的p38 MAPK及未被激活的p38 MAPK的ATP口袋，從而抑制下游底物MK2的磷酸化及其功能的發揮[19]。

目前關于下調急性PTE后肺動脈高壓的機制尚不明確，既往研究證實p38 MAPK是MCP-1產生的關鍵上游分子，抑制p38 MAPK通道可以減少MCP-1 的大量表達[17]。Gresele等[19]發現白藜蘆醇在急性缺血性心臟疾病中可通過p38 MAPK信號轉導通路減少大量炎癥趨化因子產生。Chakraborty等[20]亦報道白藜蘆醇可通過抑制p38 MAPK信號轉導通路激活減少炎癥反應發生。由此推測，SB203580可能通過抑制p38 MAPK信號轉導通路下調MCP-1的表達，減少單核細胞的募集，減輕急性PTE后炎癥細胞及炎癥介質對肺動脈內皮細胞的損傷，從而降低肺動脈壓力。為進一步探究在急性PTE 后是否可通過抑制p38 MAPK 信號轉導通路減少MCP-1的大量表達，我們加用p38 MAPK 通路特效抑制劑SB203580預孵育，結果顯示，各相同時點SB203580組MCP-1 mRNA及蛋白水平均較急性PTE組顯著降低，提示急性PTE 后SB203580通過抑制p38 MAPK信號轉導途徑下調MCP-1表達。這可能是SB203580降低急性PTE后肺動脈高壓的重要機制。

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