緩激肽對TGF-β1誘導的豬肺動脈平滑肌細胞增殖的影響*

馮文靜，　徐西振，　趙　剛，　趙俊杰，　董若蘭，　凃　玲△,　姚濟華△

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 1老年醫學科, 2心內科, 湖北 武漢 430030；3山東大學附屬省立醫院心內科，山東 濟南 250021)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一類嚴重的進展性疾病，其主要特征是肺血管阻力進行性升高，持續發展可導致患者右心衰竭而死亡[1]。肺血管重構是肺血管阻力進行性升高的重要病理生理基礎，肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖導致了肺動脈中膜的肥厚和肌化，進而導致肺部毛細血管前動脈閉塞和肺動脈壓力持續升高[2]。研究表明，轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)能刺激血管平滑肌細胞過度增殖，促進肺血管重構的發生和發展[3]。

緩激肽(bradykinin, BK)是一種血管活性九肽，通過自分泌-旁分泌機制釋放，與受體結合后發揮擴張血管、降低血壓、增加局部血流、調節平滑肌松弛和收縮、增加血管通透性等多種生物學效應[4]。研究表明，激肽釋放酶通過增加BK水平從而抑制血小板源性生長因子誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞的增殖[5]，然而，BK是否能抑制TGF-β1誘導的PASMCs增殖及其可能的分子機制尚不清楚。因此，本研究聚焦于肺血管重構的病理生理機制，旨在探討BK對TGF-β1誘導的PASMCs增殖的影響，為臨床肺血管重構的治療提供新的理論依據。

材　料　和　方　法

1材料

1.1主要試劑 豬肺動脈購自武漢市血清制品廠，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM培養基和胰酶購自HyClone。PASMCs培養于含有10%胎牛血清、0.146 g/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基。緩激肽、TGF-β1和緩激肽2型受體(bradykinin type 2 receptor, B2R)抑制劑HOE-140購自Sigma。細胞增殖/毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)試劑盒和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購自碧云天生物技術研究所，BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抗體購自Cell Signaling Technology，小鼠抗β- actin抗體、小鼠抗磷酸化細胞外信號調節激酶1/2 (phosphoylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, p-ERK1/2) 抗體、兔抗ERK1/2抗體、兔抗蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt)抗體和兔抗p-Akt抗體購自Santa Cruz。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、山羊抗小鼠 IgG抗體購自 Jackson Immuno Research Lab。Western blotting化學發光試劑購自Pierce Biotechnology，PVDF膜購自Life Science，其余試劑為國產分析純試劑。

1.2儀器Western blotting設備(Bio-Rad)，凝膠成像系統Gene Genius Bio Imaging System(Synegene)，微量紫外分光光度計(Bio-Rad)，超凈工作臺(杭州)，CO2培養箱(Forma)。

2方法

2.1PASMCs原代培養與鑒定 無菌操作下取豬肺動脈，分離肺組織中的3～4級肺小動脈，按照文獻所述的方法進行培養和傳代[6-7]，在倒置相差顯微鏡下，PASMCs融合呈梭形重疊生長，呈現典型的“谷與峰”樣特征。免疫熒光染色顯示抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)陽性，細胞純度在95%以上，實驗采用第2～6代細胞進行。

2.2實驗分組培養板中的細胞隨機分為對照組、溶媒組、BK(10-5mol/L)組、TGF-β1(2 μg/L、5 μg/L和10 μg/L)組、TGF-β1+ HOE-140組、TGF-β1+BK組以及TGF-β1+BK+HOE-140組。細胞生長至60%～70%匯合時，換含0.4%FBS的DMEM培養基同步化處理12 h，換用新鮮DMEM培養基進行相應的干預處理。為研究可能的信號轉導機制，給予BK(10-5mol/L)前1 h加用HOE-140(10-5mol/L)，BK干預作用30 min后，加入TGF-β1，繼續孵育24 h，進行CCK-8檢測細胞增殖情況或者提取相應的蛋白質進行后續分析。實驗至少重復3次。

2.3細胞活性檢測細胞活性檢測按文獻所述的方法[8]，用CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖情況。用0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶消化細胞培養瓶中處于對數生長期的PASMCs至單個細胞懸液并接種于96孔板，每孔100 μL，按上述分組和干預方法給藥，每組設5個復孔。實驗結束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(避光)，置于37 ℃細胞培養箱孵育1 h后在自動酶標儀上測定490 nm處吸光度(A490)。

2.4Western blotting檢測相關蛋白質的表達Western blotting按文獻方法[9]進行，細胞干預結束后用預冷的1×PBS洗2次，6孔板每孔加入三去污細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 150 mmol/L NaCl, 0.2 g/L NaN3, 1 g/L SDS, 100 mg/L aproti-nin, 10 g/L NP-40, 5 g/L去氧膽酸鈉, 100 mg/L PMSF)100 μL裂解細胞。用BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白濃度。取等量蛋白質加入6×loading buffer煮沸5 min，冰上靜置4 min上樣， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，將分離開的蛋白質轉至PVDF膜上，室溫封閉2.5 h，相應Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，第2天室溫下TBS-T洗滌Ⅰ抗1 h，加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育2.5 h，TBS-T洗滌1 h，ECL試劑顯影，曝光，最后用凝膠成像分析系統灰度掃描定量各組蛋白質的表達量。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，各組間差異顯著性比較應用統計軟件SPSS 13.0進行One-way ANOVA后，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1PASMCs形態及鑒定

肺動脈中膜組織塊移植于培養瓶后，培養5～7 d可見少量細胞從組織塊邊緣爬出，細胞呈不規則多角形，并逐漸伸展成梭形或長梭形。部分區域可見PASMCs融合呈梭形重疊生長，呈現典型的“谷與峰”樣特征。免疫熒光染色結果見圖1，95%以上細胞抗α-SMA陽性，胞漿顯示綠色熒光標記的肌動蛋白結構，胞核呈橢圓形位于細胞中央被染成藍色。

Figure 1. Immunofluorescence staining of PASMCs (×200). A: cytoplasmic positive staining for α-SMA; B: nucleus; C: merged image.

圖1PASMCs免疫熒光染色

2TGF-β1呈劑量依賴性地促進PASMCs增殖

TGF-β1(2 μg/L、5 μg/L和10 μg/L)刺激PASMCs 24 h后進行CCK-8檢測，結果見圖2。與對照組和溶媒組相比較，TGF-β1(2 μg/L)組對PASMCs增殖無明顯影響，而TGF-β1(5 μg/L)組與TGF-β1(10 μg/L)組顯著促進了PASMCs增殖(P<0.05)，并且以TGF-β1(10 μg/L)組更為顯著，因此后續實驗采用TGF-β1(10 μg/L)進行。這些實驗結果提示TGF-β1呈劑量依賴性地促進PASMCs增殖。

3BK通過B2R抑制TGF-β1誘導的PASMCs增殖

PASMCs接受TGF-β1刺激時分別合用BK與B2R抑制劑HOE-140，CCK-8檢測它們對TGF-β1誘導的PASMCs增殖的影響，結果見圖3。與對照組和溶媒組相比較，單獨應用BK (10-5mol/L) 對PASMCs的增殖作用沒有顯著影響(P>0.05)，TGF-β1(10 μg/L)可以顯著促進PASMCs增殖(P<0.05)。與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組顯著抑制了TGF-β1誘導的PASMCs增殖(P<0.05)。而合用B2R抑制劑HOE-140 (10-5mol/L) 后，BK抑制TGF-β1誘導的PASMCs增殖作用顯著降低(P<0.05)。這些數據說明BK通過B2R調節TGF-β1誘導的PASMCs增殖作用。

Figure 2. Effects of different concentrations of TGF-β1on the proliferation of PASMCs.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group or vehicle group.

圖2不同濃度TGF-β1處理對PASMCs增殖的影響

Figure 3. Effect of bradykinin (BK) on the proliferation of PASMCs induced by TGF-β1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖3BK對TGF-β1誘導的PASMCs增殖的影響

4BK對TGF-β1誘導的PASMCsPI3K蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，與對照組相比較，溶媒組PI3K蛋白的表達無明顯改變(P>0.05)，TGF-β1明顯上調了PI3K的表達(P<0.05)；與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組PI3K的表達顯著降低(P<0.05)，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(P<0.05)，見圖4。

5BK對TGF-β1誘導的PASMCsp-Akt蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示,與對照組相比較，溶媒組p-Akt蛋白的表達無明顯改變(P>0.05)，TGF-β1明顯上調了p-Akt的表達(P<0.05)；與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組p-Akt的表達顯著降低(P<0.05)，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. Expression of PI3K protein in PASMCs treated with vehicle, TGF-β1, BK or B2R inhibitor (HOE-140) as indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖4BK對TGF-β1誘導的PASMCsPI3K表達的影響

6BK對TGF-β1誘導的PASMCsp-ERK1/2蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，與對照組相比較，溶媒組p-ERK1/2蛋白的表達無明顯改變(P>0.05)，TGF-β1明顯上調了p-ERK1/2的表達(P<0.05)；與TGF-β1組相比較，TGF-β1+BK組p-ERK1/2的表達顯著降低(P<0.05)，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應(P<0.05)，見圖6。

討　　論

肺血管重構主要包括肺動脈內膜損害、中膜肥厚和外膜增厚，肺血管內皮細胞凋亡參與了PAH發病的重要起始環節[10]。Sakao等[11]研究發現，凋亡的肺血管內皮細胞分泌的血管內皮生長因子和TGF-β1能刺激血管平滑肌細胞過度增殖，促進肺血管重構。Sturrock等[12]研究發現，PAH發病過程中存在TGF-β1表達增加并且促進了PASMCs增殖。 細胞實驗證實，TGF-β1可以促進PASMCs由G0/G1期進入G2/M+S期，從而調控細胞周期進展。 動物實驗也發現，抑制TGF-β1可以降低肺血管重構和右心室壓力[2]。本研究應用TGF-β1誘導原代培養的豬PASMCs增殖，發現TGF-β1呈劑量依賴性地促進PASMCs增殖，TGF-β1(10 μg/L)作用24 h，可以顯著誘導豬PASMCs增殖，這與文獻報道[2]是一致的，說明TGF-β1誘導PASMCs增殖模型制作成功。

Figure 5. Expression of p-Akt protein in PASMCs treated with vehicle, TGF-β1, BK or B2R inhibitor (HOE-140) as indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖5BK對TGF-β1誘導的PASMCsp-Akt表達的影響

Figure 6. Expression of p-ERK1/2 protein in PASMCs treated with vehicle, TGF-β1, BK or B2R inhibitor (HOE-140) as indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and vehicle group;#P<0.05vsTGF-β1group;△P<0.05vsTGF-β1+BK group.

圖6BK對TGF-β1誘導的PASMCsp-ERK1/2表達的影響

本實驗中，CCK-8結果顯示，TGF-β1組顯著誘導了PASMCs增殖，加用BK后TGF-β1誘導的PASMCs增殖作用顯著降低，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應。Western blotting結果也顯示，BK顯著抑制了TGF-β1誘導的PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的激活，而HOE-140明顯阻斷了BK的效應。這些數據說明BK是通過B2R調節TGF-β1誘導的PASMCs增殖作用。

BK是一種血管活性九肽，是激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein-kinin system, KKS)中的重要活性物質成分，主要通過自分泌-旁分泌機制釋放，與受體結合后發揮擴張血管、降低血壓、增加局部血流、調節平滑肌松弛和收縮、增加血管通透性，改善腎功能等多種生物學效應[4]。B2R是一種跨膜G蛋白偶聯受體，廣泛表達于大多數組織[13]。已有研究報道，重組腺病毒介導的人組織激肽釋放酶基因轉染通過B2R抑制血小板源性生長因子誘導的自發性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖[5]。本研究發現，B2R抑制劑HOE-140明顯阻斷了BK抑制TGF-β1誘導的PASMCs增殖作用，該作用主要是通過阻斷PI3K/Akt和ERK1/2信號通路而實現。

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