應用雙槽電化學腐蝕法制備用于蛋白質芯片構建的多孔硅基底

摘要：通過雙槽電化學腐蝕法制備大面積（12 mm × 58 mm）均勻的多孔硅片，以小鼠免疫球蛋白G（IgG）與兔抗小鼠IgG抗體的相互作用為模型，證明其表面修飾環氧基團后能作為一種基底材料用于蛋白質微陣列芯片的構建。結果表明，兔抗小鼠IgG抗體檢測的靈敏度與多孔硅基底制備時所采用的腐蝕電流密度、腐蝕時間、氫氟酸濃度有關。當電流密度為500 mAcm2，腐蝕時間為450 s，HF濃度為25%時，IgG在多孔硅基底上的固定量最大，IgG芯片對兔抗小鼠IgG抗體的檢出限為10 靏L，檢測線性范圍為0.32～10.0 mgL。本方法制備的大面積均勻的多孔硅基底能夠應用于蛋白質芯片的制作，并具有制備工藝簡單，蛋白質固定量大等優點。

關鍵詞：雙槽電化學腐蝕法；多孔硅基底；蛋白質芯片；抗體檢測

1引言

1990年，Canham等[1]報道了多孔硅光致發光現象以后，多孔硅逐漸為人們所重視，并廣泛應用于生物傳感器、藥物運輸、光電器件、太陽能電池等領域[2，3]。多孔硅表面的納米結構與腐蝕電流密度、腐蝕時間、HF濃度有關。

相比于傳統的分析方法，蛋白質芯片（Protein microarray）可以實現成千上萬個樣品的高通量平行分析，具有自動化和微量化等優點。蛋白質芯片通常以功能化的平板玻璃片為基底，應用所修飾的官能團與蛋白質的氨基或羧基等殘基反應而實現蛋白質的固定[4]。相對于二維玻璃基底，多孔硅表面具有三維納米結構，大的比表面積（500 m2g）， 并且多孔硅生物相容性好， 以及表面易修飾不同的官能基團（環氧、醛基、氨基等）而實現功能化 [5～10]，因此多孔硅能作為一種優良的基底材料應用于蛋白質芯片的制作。目前，已有一些研究組嘗試將多孔硅基底應用于生物芯片的制作[2，11]。由于大面積且表面均勻的多孔硅不容易制備，所獲得的多孔硅尺寸通常較小，不利于大規模微陣列蛋白質芯片的制作和數據的采集。另外，多孔硅制備條件對蛋白質芯片檢測結果的影響尚缺乏系統研究。

本研究采用自制電解池，采用雙槽電化學腐蝕法[12～15]，制作了大面積均勻的多孔硅基底，并考察了在不同的腐蝕電流密度、腐蝕時間、HF濃度條件下，所獲得的多孔硅基底對小鼠IgG固定效果的影響。成功制作了一種能夠應用于蛋白質芯片構建的大面積均勻的多孔硅基底材料。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

晶芯SmartArrayer48微陣列芯片點樣儀和晶芯LuxScan10K微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物技術有限公司）； CHI660D電化學工作站（上海辰化儀器有限公司）； HPC250CL恒溫恒濕箱（上海申賢恒溫設備廠）； ZKF035電熱真空干燥箱和101A1ET電熱鼓風干燥箱（上海實驗儀器有限公司）；TH2300恒溫培養搖床（北京桑翌科技發展有限公司）； PHS3BW pH計（上海理達儀器廠）； 5415R型高速離心機（德國Eppendorf公司）；XL30ESEMFEG場發射掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；IFS66VS傅立葉變換紅外光譜儀（德國布魯克公司）。

3結果與討論

3.1多孔硅基底制備條件的優化

3.1.1腐蝕電流密度的影響固定制備多孔硅基底的腐蝕時間為600 s，HF濃度為25%，改變腐蝕電流密度，應用自制電解池采用雙槽電化學腐蝕法獲得了3種腐蝕電流密度（100，300和500 mAcm2）下的多孔硅基底。在表面修飾環氧基團后，制備小鼠IgG芯片與固定濃度（10 mgL）FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體反應。結果表明，腐蝕電流密度為500 mAcm2時，熒光強度最大（圖2），證明該電流密度下小鼠IgG固定量最多。蛋白質在多孔硅基底上的固定量隨腐蝕電流密度的增加而增大，這是因為隨著腐蝕電流密度的增加，多孔硅表面的孔徑逐漸增大，比表面積隨之增加，從而使蛋白質在多孔硅表面的負載量得到相應的提高。但在大腐蝕電流密度（_Symbol～@@_500 mAcm2）作用下，隨著多孔硅孔徑的增大孔壁逐漸變薄，孔狀納米結構的強度降低，受到溶液表面張力的影響，納米結構發生龜裂使多孔硅在溶液中的穩定性大幅降低，表面發生坍塌。因此，多孔硅的最佳腐蝕電流密度選擇500 mAcm2。

3.2多孔硅基底的表征

優化條件下（腐蝕電流密度500 mAcm2，腐蝕時間450 s，HF濃度25%）所制備多孔硅基底表面的結構如圖5所示。多孔硅表面的納米結構規整，孔洞分布均勻，排列致密，孔徑分布在15 nm左右。孔狀結構增大了多孔硅基底的比表面積，從而提高了蛋白質在芯片表面的負載量，有助于提高芯片檢測的靈敏度。

3.3平板單晶硅環氧玻璃片多孔硅基底對蛋白質固定效果的比較

將2 gL的小鼠IgG固定于3種基底（平板單晶硅，環氧玻璃片，多孔硅）表面，制作小鼠IgG芯片與等量的FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體反應。如圖7所示，多孔硅基底表面的熒光強度是商品化環氧玻璃片的3.7倍，平板單晶硅的5.3倍。結果表明，具有較大比表面積的多孔硅基底對蛋白質固定效果明顯優于平板單晶硅和環氧玻璃片。在3種基底中多孔硅基底背景最低，且多孔硅基底表面陣列點的直徑介于平板單晶硅和環氧玻璃片之間，這說明多孔硅基底表面的親疏水性適中，容易獲得高質量的蛋白質陣列。