核酸酶催化放大傳感體系的設計及其在鉛離子比色檢測中的應用

摘要：基于817 DNA酶的催化切割特性和類辣根過氧化物酶DNA酶的氧化還原反應催化特性，發展了一種新型核酸酶催化放大傳感體系，并用于Pb2+的比色檢測。考察了K+濃度，pH值及反應時間對檢測體系的影響。ABTS吸光度變化與Pb2+濃度在5.0～100 nmolL范圍內呈良好的線性關系，檢出限為3.0 nmolL。此外，因Pb2+酶的特異性，本方法對Pb2+具有良好的選擇性。

關鍵詞：DNA酶； 比色檢測； 催化放大； 生物傳感； 鉛離子

1引言

當前，重金屬污染仍然是一個全球性問題，特別是在發展中國家，已對人體健康造成了重大傷害[1]。我國規定：飲用水中Pb2+含量不得高于50 _SymbolmA@_gL。目前，Pb2+的檢測方法主要有雙硫腙比色法、原子熒光法[2]、原子吸收光譜法[3]、氣相色譜法、離子交換色譜法、陽極溶出伏安法、微分電位溶出法和極譜法等儀器分析方法[4]。這些方法一般操作復雜、儀器價格較高、且靈敏度有待提高。近年來，許多研究者致力于發展Pb2+檢測新方法，如基于生物分子及納米材料的生物傳感方法等[5]。然而這些方法或多或少的存在一些缺陷，使之廣泛應用受到了限制。

核酸、核酸酶探針易于合成，性質穩定，使用方便，已得到廣泛的研究和應用[6]。對于核酸探針，具有代表性的如核酸適配體（Aptamer）[7]， 發夾結構的分子信標[8]， 以及其它基于DNA構象變化的DNA生物探針[9]。核酸酶是通過體外選擇（In vitroselection）得到的一類新型功能核酸[10]。不同的DNA酶可以催化不同的化學反應，包括DNA或RNA的切割連接反應、磷酸化、氨基磷酸酯鍵的切割等。與蛋白酶相比，DNA酶具有高穩定性，在生物化學和藥物領域具有廣闊的應用前景。許多DNA酶催化活性需要依賴于特定金屬離子的輔助，從而為應用于特定金屬離子的檢測提供了可能。利用這種特性的生物傳感檢測已有報道[11～13]。此外，另一種讓人感興趣的DNA酶是由G四股螺旋超分子結構結合血紅素（Hemin）而成[14]。它具有過氧化物酶的催化活性，能夠催化氧化雙氧水介導的底物體系，如魯米諾，ABTS（2，2聯氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸））和TMB （3，3′，5，5′四甲基聯苯二胺）。表現出化學發光、紫外吸收以及顏色改變等信號的變化，具有優越的分析應用意義[15]。

本研究將具有不同功能特性的核酸序列組合到一起，發展了一種核酸酶催化放大比色傳感平臺，并用于Pb2+的比色檢測。實驗原理如圖1所示，將富G核酸序列封閉于發夾結構探針中，當存在Pb2+時，發夾結構探針被切斷，釋放富G核酸序列，與Hemin結合形成DNA酶，引發顯色反應。通過吸收信號的響應即可達到檢測Pb2+的目的。

其中探針部分包含17E的底物鏈序列和構成催化DNA酶的富G序列。探針被設計為發夾結構，以實現對Pb2+的特異性顯色。顯色體系中所用的Pb2+DNA酶序列為經典的“817”脫氧核酶結構[11]，在Pb2+存在下顯示出很高的催化切割活性。底物鏈是一個DNA與RNA嵌合體，剪切位點有一個腺嘌嶺核酸核苷（rA），其余堿基全部為脫氧核糖核苷酸。當不存在Pb2+時，也就是DNA酶不切割的情況下，探針的‘Loopstem’發夾結構非常穩定，富G序列由于雜交配對被封閉，所以不能形成G四鏈體Hemin復合結構，即不能催化底物發生氧化還原顯色反應。當存在Pb2+時，DNA酶切斷了發夾結構探針的Loop部分，Loopstem發夾結構被破壞，只有幾個堿基配對的雙鏈莖部不能穩定存在，因此釋放出富G序列與Hemin結合，形成具有很強過氧化物酶活性的DNA酶，催化ABTSH2O2發生顯色反應，反應液的紫外吸收值的變化與Pb2+的濃度相關（圖2）。從圖2c可見，當不加入Pb2+時，體系仍有很高的吸收，說明17E會與發夾探針的Loop部分雜交，導致探針的Loopstem發夾結構不穩定或被破壞[16]，從而釋放出富G序列與Hemin結合，形成G四鏈體復合結構，催化底物進行顯色反應，增加檢測體系的背景信號。所以，本實驗加入Anti17E互補結合17E，以降低檢測體系的背景信號。

3.2.2溶液pH值的影響在形成G四鏈體過程中，層間的G堿基之間是通過氫鍵的作用連接在一起的。由于 pH值影響氫鍵形成，實驗中考察了溶液pH值對檢測體系的影響。如圖4所示，在溶液pH為6.0～7.0時，體系的紫外吸收變化不大。當溶液pH>7后，隨著pH值升高，體系的信號響應逐漸降低。當pH=8.0時，本體系的紫外吸收變化幾乎為零。所以在本實驗體系中，溶液酸度選擇為pH=7.0。

3.2.3酶切速率的考察在Pb2+存在下，底物被催化切割的速率加快[13]，從而釋放出富G序列，形成G四鏈體結構。從圖5可見，當反應時間達到30 min后，體系的紫外吸收變化達到穩定。表明在Pb2+存在下，酶催化底物的切割反應速率非常快；在沒有酶和Pb2+的自發水解條件下，切割反應速率非常慢。為了保證酶催化切割反應的充分進行，且可忽略底物的自發水解對檢測的影響，在Pb2+檢測實驗中反應時間選擇30 min。