應用于Bottomup蛋白質鑒定的質譜數據采集策略研究進展

摘要：蛋白質組的高度復雜性給基于質譜的蛋白質鑒定提出了很大的挑戰。技術需求促進質譜技術不斷向前發展。儀器平臺在軟硬件方面的進步，為高通量蛋白質鑒定提供了更多選擇和支撐。但是，儀器性能的充分發揮，還需要根據生物學問題的需求和分析樣本的特性，設計高質量的數據采集策略。本文對目前高通量蛋白質鑒定中已開發的質譜數據采集策略進行了綜述，重點介紹了Bottomup策略中使用的簡單重復、離子排除和監測、在線智能化掃描和分段掃描等技術，并關注了這些策略對高通量蛋白質鑒定的影響，總結了各種策略的優缺點并展望了其未來發展方向。

關鍵詞：蛋白質鑒定； 質譜； 數據采集策略； 評述

1引言

蛋白質組具有動態范圍寬、種類和物理化學屬性十分復雜等特性，這在技術層面給蛋白質組鑒定研究提出了很大的挑戰。不斷深入的科學問題給實驗技術的發展提出了諸多需求，促使質譜技術不斷進步，分辨率、準確度、掃描速度和靈敏度等指標不斷提升。例如，三級串聯飛行時間質譜儀（Triple time of flight mass spectrometry， TripleTOF MS）5600將串聯圖譜 （Tandem mass spectrum， MS/MS）掃描速度提升到100 Hz，同時保證了很高的分辨率 （30，000） 和精度（<2 ppm）[1]。最近，熱電公司（Thermo Scientific）發布的Orbitrap Elite在m/z 400處的分辨率達到了240，000[2]。為了處理復雜的樣本，儀器控制軟件引入了很多智能化的控制策略。例如，Orbitrap系列質譜儀的 “topN”策略，加上引入具有魯棒性的動態排除，能夠有效地選擇母離子進行MS/MS分析。基于這些底層技術的支持，很多數據采集策略被設計出來，用于復雜樣本的蛋白質組學分析。

目前，基于質譜的高通量蛋白質鑒定已經取得了很多研究成果。在分離富集策略的支持下，對小鼠和大鼠的多個組織進行分析，磷酸化位點已經接近36，000個，鑒定的磷酸化蛋白質超過了7，000個[3，4]。Topdown策略已經能夠鑒定人細胞的1043個基因的表達產物，包含由可變剪切、翻譯后修飾等引入的3000多個不同蛋白質[5]。在人類樣本分析中，3次重復實驗已經能夠鑒定5376個蛋白質，覆蓋了200個KEGG[http：//www.genome.jp/kegg/]收錄通路（Pathway）的173個[6]。在酵母（Saccharomyces cerevisiae） 樣本分析中，單次實驗（Singlerun）鑒定的蛋白質已經達到3923個[7]。

但是，質譜技術的進步并不能解決高通量蛋白質鑒定面臨的所有問題。面對復雜樣本，質譜的數據采集策略還有待于提高。Michalski等[8]利用LTQ Oribitrap對HeLa細胞進行分析，發現一級質譜（MS spectrum）檢測到的100，000個以上的肽段信號中，僅僅有16%的信號進行了串聯質譜分析。Scherl等則發現LTQOrbitrap數據關聯分析中存在大約8%的“孤兒”肽段，也就是產生MS/MS的肽段母離子在MS中并沒有出現[9]。另外，蛋白質序列數據庫經過理論酶切產生的肽段中，還有很大一部分是不能被LCMS/MS平臺檢測到的。丟失的原因來自離子化效率、信號抑制和色譜分離中的損失等[10]。對酵母的ORF翻譯得到的所有蛋白質進行理論酶切（SGD[http：//www.yeastgenome.org/] 2011.2發布，采用美國西南太平洋國家實驗室PNNL發布的Protein Digestion Simulator Basic軟件，設定胰蛋白酶，兩個漏切位點，分子量范圍為400～5000 Da），產生了835，482個酶切肽段，如果考慮不同的電荷（電噴霧電離中，很多肽段會同時產生+1，+2和+3電荷離子）[11]和翻譯后修飾，樣本中待分析的肽段離子數量會遠多于這個數字。很多研究團隊對理論酶切肽段的質量分布做過分析，即使精度達到1 ppm，在單位區間內，還會有至少幾百個肽段同時存在[12，13]。

因此，除了不斷努力提升質譜儀的性能指標及其相關的分離、電離和碎裂技術外，還需要設計高質量的數據采集策略以進一步提升質譜產出能力和蛋白質組鑒定覆蓋度[14，15]。近年來，在底層軟硬件技術的支持下，應用于Bottomup蛋白質鑒定的數據關聯采集（Data dependent acquisition，DDA）從簡單重復，到離子排除和監測，再到在線的智能化掃描等數據采集策略不斷被嘗試和開發，而數據獨立采集（Data independent acquisition，DIA）也有母離子全掃描和分段掃描等策略逐漸被提出（見圖1）。這些策略的開發是生物信息學分析、生物實驗技術和質譜平臺相結合的產物，旨在提高圖譜獲取的有效性和靶標性，提高單次實驗的產出能力和實驗檢測的靈敏度。本文將針對基于Bottomup的蛋白質鑒定中旨在提高蛋白質鑒定覆蓋度和產出能力的質譜數據采集策略進行綜述，且主要圍繞熱電公司的傅里葉變換系列質譜儀（FTMS）進行展開。