雙填料固相萃取高效液相色譜/質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)腌菜中9種N亞硝胺

摘要：亞硝胺是三大強(qiáng)致癌食品污染物之一，普遍存在于腌制和熱加工食品中。本研究建立了一種基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描（MRM）檢測(cè)N亞硝胺的新型固相萃取液相色譜方法，可以快速直接檢測(cè)腌菜中9種N亞硝胺。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了液相色譜分離與檢測(cè)條件，同時(shí)考察了4種固相萃取單柱（堿性氧化鋁Al2O3、C18、硅膠、硅藻土）和2種雙填料的混合固相萃取柱（Al2O3C18， Al2O3硅膠）吸附解析的凈化效果。結(jié)果表明，采用Al2O3C18混合柱純化，液相色譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量，對(duì)9種亞硝胺的回收率達(dá)75.7%～116.0%，檢出限為0.20～0.49 mg/L。采用本方法檢測(cè)不同產(chǎn)地的6類腌菜產(chǎn)品中亞硝胺含量，二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺的檢出率相對(duì)較高，分別為37.5%和25.0%，其中二乙基亞硝胺在雪里蕻腌菜中最高含量達(dá)59.1 mg/L，亞硝基嗎啉在所有樣品中未檢出。

關(guān)鍵詞：N亞硝胺；液相色譜；質(zhì)譜；雙填料固相萃??；腌菜

1引言

N亞硝胺是世界公認(rèn)的強(qiáng)致癌性食品污染物，在食品加工和貯藏過(guò)程中形成的亞硝胺是人體中亞硝胺的主要來(lái)源。腌制、油炸、煙熏、焙烤、飲用水等食品中均有檢測(cè)出亞硝胺的報(bào)道[1～5]。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，亞硝胺具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性、誘變性，可導(dǎo)致神經(jīng)中毒、腎中毒、致畸，誘導(dǎo)肝、肺、腸、胃等癌變，嚴(yán)重威脅人體健康[6]。

腌制食品是含亞硝胺的代表性食品，傳統(tǒng)的腌制工藝中由于其前體亞硝酸鹽及胺類的廣泛存在，或添加亞硝酸鹽作為防腐劑和發(fā)色劑，大大增加了亞硝胺的生成概率，因此對(duì)亞硝胺的檢測(cè)、控制亞硝胺的形成尤為重要[7，8]。目前，亞硝胺的測(cè)定主要通過(guò)水蒸汽蒸餾、液液萃?。↙LE）、固液萃取法（SLE）提取[9～12]，氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）[13，14]、氣相熱能分析儀（GCTEA）[15，16]、液相色譜（HPLC）[17～19]、氣相色譜[20]、液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)方法（HPLCMS）檢測(cè)[21，22]。但是腌菜樣品基質(zhì)復(fù)雜，N亞硝胺含量相對(duì)較低，凈化分離難、不穩(wěn)定，常規(guī)檢測(cè)方法存在分析程序復(fù)雜、檢測(cè)種類少等缺點(diǎn)。目前對(duì)蔬菜類腌制食品中N亞硝胺類化合物的檢測(cè)報(bào)道較少。

固相萃取技術(shù)可以高效、快速并大批量處理樣品，不僅提高了分析質(zhì)量和效率，減少有機(jī)溶劑使用量，節(jié)約成本，而且可以降低環(huán)境污染。Al2O3是一種常規(guī)無(wú)機(jī)萃取材料，穩(wěn)定性好，吸附性強(qiáng)；C18作為一種高效有機(jī)型萃取材料，適用范圍廣，也常被應(yīng)用于食品污染物檢測(cè)分析的預(yù)處理[23]。本實(shí)驗(yàn)首先采用HPLC/MS結(jié)合MRM掃描對(duì)9種N亞硝胺進(jìn)行定性分析，根據(jù)9種亞硝胺的不同分子極性特點(diǎn)并結(jié)合腌菜樣品基質(zhì)的復(fù)雜性研究單種填料和混合填料對(duì)亞硝胺的分離純化效果。建立了雙填料（Al2O3C18）混合固相萃取柱凈化腌菜亞硝胺提取樣品的新方法，經(jīng)高效液相色譜分離檢測(cè)，定量分析腌菜中的亞硝胺，取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、實(shí)現(xiàn)了有機(jī)無(wú)機(jī)混合材料分離純化復(fù)雜基質(zhì)樣品中的痕量亞硝胺，可用于普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同食品中N亞硝胺的快速直接檢測(cè)，為食品安全檢測(cè)和評(píng)價(jià)提供實(shí)際參考依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

LTQXL超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo公司），15252998高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；VPODS C18 色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm，日本SHIMADZU公司）；R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；NEVAP氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；固相萃取裝置（天津Auto Science公司）；MilliQ Integral超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品（Nitrosamines，純度>98%）、冰乙酸（色譜純），均購(gòu)自Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨（色譜純，國(guó)藥公司）；固相萃取柱層析用C18（10 μm，美國(guó)Alltech公司）；Al2O3（100～200目，國(guó)藥公司）；硅膠（200～300目，青島海洋公司）；硅藻土（上海奉賢公司）。

2.2樣品預(yù)處理

2.2.1樣品提取從超市分別采購(gòu)最新批次雪里蕻腌菜、酸豆角、腌蘿卜干、榨菜、冬菜及紅油豇豆，準(zhǔn)確稱取上述樣品各10.0 g，加入20 mL純水，浸提4 h，初濾后，低溫真空旋蒸濃縮至5 mL，8000 r/min離心15 min，取上清液置于10 mL試管中，2 ℃冷藏保存。

2.2.2樣品凈化分別稱取2.5 g Al2O3和C18，裝填至85 mm×20 mm的固相萃取柱，用水、甲醇和正戊烷進(jìn)行預(yù)處理，將提取的樣液以2.0 mL/min流速過(guò)Al2O3C18固相萃取柱，用20 mL正戊烷淋洗除雜，20 mL甲醇以1.0 mL/min流速洗脫回收待測(cè)物質(zhì)，收集洗脫液后經(jīng)過(guò)低溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀部分濃縮至1～2 mL，轉(zhuǎn)移至濃縮瓶，通過(guò)氮吹儀濃縮至干，定容至1 mL。進(jìn)樣分析前溶液經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.3檢測(cè)方法

2.3.1液相色譜條件進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.8 mL/min；波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：乙腈水，梯度洗脫：0～16 min，20%～100% 乙腈。